Immunoprécipitation de la chromatine - Chromatin immunoprecipitation

Flux de travail de séquençage de puces

L'immunoprécipitation de la chromatine ( ChIP ) est un type de technique expérimentale d' immunoprécipitation utilisée pour étudier l'interaction entre les protéines et l' ADN dans la cellule. Il vise à déterminer si des protéines spécifiques sont associées à des régions génomiques spécifiques, telles que des facteurs de transcription sur des promoteurs ou d'autres sites de liaison à l'ADN , et éventuellement définissant des cistromes . ChIP vise également à déterminer l'emplacement spécifique dans le génome auquel diverses modifications d' histones sont associées, indiquant la cible des modificateurs d'histones.

En bref, la méthode conventionnelle est la suivante :

  1. L'ADN et les protéines associées sur la chromatine dans les cellules ou les tissus vivants sont réticulés (cette étape est omise dans Native ChIP).
  2. Les complexes ADN-protéine (chromatine-protéine) sont ensuite cisaillés en fragments d'ADN d'environ 500 pb par sonication ou digestion par nucléase.
  3. Des fragments d'ADN réticulés associés à la ou aux protéines d'intérêt sont sélectivement immunoprécipités à partir des débris cellulaires en utilisant un anticorps spécifique de protéine approprié.
  4. Les fragments d'ADN associés sont purifiés et leur séquence est déterminée. L'enrichissement de séquences d'ADN spécifiques représente des régions du génome auxquelles la protéine d'intérêt est associée in vivo .

Puce typique

Il existe principalement deux types de ChIP, se différenciant principalement par la préparation de chromatine de départ. La première utilise de la chromatine réticulée réversiblement cisaillée par sonication appelée puce réticulée (XChIP). Native ChIP (NChIP) utilise de la chromatine native cisaillée par digestion par nucléase micrococcale .

Puce réticulée (XChIP)

La puce réticulée est principalement adaptée à la cartographie de la cible ADN des facteurs de transcription ou d'autres protéines associées à la chromatine, et utilise la chromatine réticulée de manière réversible comme matériau de départ. L'agent de réticulation réversible pourrait être le formaldéhyde ou la lumière UV . Ensuite, la chromatine réticulée est généralement cisaillée par sonication, fournissant des fragments de 300 à 1000 paires de bases (pb) de longueur. Une réticulation douce au formaldéhyde suivie d'une digestion par une nucléase a été utilisée pour cisailler la chromatine. Des fragments de chromatine de 400 à 500 pb se sont avérés appropriés pour les tests ChIP car ils couvrent deux à trois nucléosomes .

Les débris cellulaires dans le lysat cisaillé sont ensuite éliminés par sédimentation et les complexes protéine-ADN sont sélectivement immunoprécipités à l'aide d' anticorps spécifiques contre la ou les protéines d'intérêt. Les anticorps sont couramment couplés à de l' agarose , du sépharose ou des billes magnétiques. Alternativement, les complexes chromatine-anticorps peuvent être sélectivement retenus et élués par des disques polymères inertes. Les complexes immunoprécipités (c'est-à-dire le complexe billes-anticorps-protéine-séquence d'ADN cible) sont ensuite collectés et lavés pour éliminer la chromatine non spécifiquement liée, la liaison croisée protéine-ADN est inversée et les protéines sont éliminées par digestion avec la protéinase K . Une version marquée par un épitope de la protéine d'intérêt, ou une biotinylation in vivo peut être utilisée à la place des anticorps dirigés contre la protéine d'intérêt native.

L'ADN associé au complexe est ensuite purifié et identifié par amplification en chaîne par polymérase (PCR), microarrays ( ChIP-on-chip ), clonage et séquençage moléculaires, ou séquençage direct à haut débit ( ChIP-Seq ).

Puce native (NChIP)

Native ChIP est principalement adapté pour cartographier la cible ADN des modificateurs d' histones . Généralement, la chromatine native est utilisée comme chromatine de départ. Lorsque les histones s'enroulent autour de l'ADN pour former des nucléosomes, elles sont naturellement liées. Ensuite, la chromatine est cisaillée par digestion par nucléase micrococcale, qui coupe l'ADN à la longueur du lieur, laissant les nucléosomes intacts et fournissant des fragments d'ADN d'un nucléosome (200 pb) à cinq nucléosomes (1000 pb) de long. Par la suite, des méthodes similaires à XChIP sont utilisées pour éliminer les débris cellulaires, immunoprécipiter la protéine d'intérêt, éliminer la protéine du complexe immunoprécipité et purifier et analyser l'ADN associé au complexe.

Comparaison de XChIP et NChIP

Le principal avantage du NChIP est la spécificité des anticorps . Il est important de noter que la plupart des anticorps dirigés contre les histones modifiées sont dirigés contre des antigènes peptidiques synthétiques non fixés et que les épitopes qu'ils doivent reconnaître dans le XChIP peuvent être perturbés ou détruits par la réticulation du formaldéhyde , d'autant plus que les réticulations sont susceptibles de impliquent des groupes e-amino lysine dans les terminaisons N, perturbant les épitopes. Cela explique probablement la faible efficacité des protocoles XChIP par rapport à NChIP.

Mais XChIP et NChIP ont des objectifs et des avantages différents l'un par rapport à l'autre. XChIP sert à cartographier les sites cibles des facteurs de transcription et d'autres protéines associées à la chromatine ; NChIP sert à cartographier les sites cibles des modificateurs d'histones (voir le tableau 1).

Tableau 1 Avantages et inconvénients de NChIP et XChIP

XChIP NChIP
Avantages Convient aux facteurs de transcription ou à toute autre protéine associée à la chromatine faiblement liante.
Applicable à tous les organismes où la protéine native est difficile à préparer 		Spécificité des anticorps testables
Meilleure spécificité des anticorps en tant que protéine cible naturellement intacte

Meilleure efficacité de récupération de la chromatine et des protéines grâce à une meilleure spécificité des anticorps

Désavantages Récupération inefficace de la chromatine en raison de la perturbation de l'épitope de la protéine cible de l'anticorps
Peut provoquer un résultat faussement positif en raison de la fixation des protéines transitoires à la chromatine
Large gamme de taille de cisaillement de la chromatine en raison de la coupe aléatoire par sonication. 		Ne convient généralement pas aux protéines non histones
Les nucléosomes peuvent se réorganiser pendant la digestion

Historique et nouvelles méthodes de puce

En 1984, John T. Lis et David Gilmour, à l'époque étudiants diplômés du laboratoire de Lis, ont utilisé l'irradiation UV, un agent de réticulation protéine-acide nucléique de longueur nulle, pour réticuler de manière covalente des protéines liées à l'ADN dans des cellules bactériennes vivantes. Après la lyse des cellules réticulées et l'immunoprécipitation de l'ARN polymérase bactérienne, l'ADN associé à l'ARN polymérase enrichie a été hybridé à des sondes correspondant à différentes régions de gènes connus pour déterminer la distribution et la densité in vivo de l'ARN polymérase au niveau de ces gènes. Un an plus tard, ils ont utilisé la même méthodologie pour étudier la distribution de l' ARN polymérase II eucaryote sur les gènes de choc thermique des mouches des fruits. Ces rapports sont considérés comme les études pionnières dans le domaine de l'immunoprécipitation de la chromatine. XChIP a été modifié et développé par Alexander Varshavsky et ses collègues, qui ont examiné la distribution de l' histone H4 sur les gènes de choc thermique en utilisant la réticulation du formaldéhyde. Cette technique a été largement développée et affinée par la suite. L'approche NChIP a été décrite pour la première fois par Hebbes et al ., 1988, et a également été développée et affinée rapidement. Le test ChIP typique prend généralement 4 à 5 jours et nécessite au moins 10 6 ~ 10 7 cellules. Désormais, de nouvelles techniques sur puce pourraient être réalisées à partir de 100 à 1 000 cellules seulement et terminées en une journée.

  • ChIP sans billes : cette nouvelle méthode de ChIP utilise des disques de polymère inerte et poreux fonctionnalisés avec de la protéine A ou G dans des colonnes de centrifugation ou des microplaques. Le complexe chromatine-anticorps est sélectivement retenu par le disque et élue pour obtenir un ADN enrichi pour des applications en aval telles que la qPCR et le séquençage. L'environnement poreux est spécifiquement conçu pour maximiser l'efficacité de capture et réduire la liaison non spécifique. En raison de moins de manipulations manuelles et de protocoles optimisés, ChIP peut être exécuté en 5 heures.
  • Carrier ChIP (CChIP): Cette approche pourrait utiliser aussi peu que 100 cellules en ajoutant des cellules de drosophile comme chromatine porteuse pour réduire la perte et faciliter la précipitation de la chromatine cible. Cependant, cela nécessite des amorces très spécifiques pour la détection de la chromatine de la cellule cible à partir du fond de chromatine du support étranger, et cela prend deux à trois jours.
  • Fast ChIP (qChIP) : le test de puce rapide a réduit le temps en raccourcissant deux étapes dans un test de puce typique : (i) un bain à ultrasons accélère le taux de liaison des anticorps aux protéines cibles et réduit ainsi le temps d'immunoprécipitation (ii) une résine- La procédure d'isolement d'ADN basée sur (Chelex-100) réduit le temps d' inversion de la liaison croisée et d'isolement d'ADN. Cependant, le protocole rapide ne convient que pour les échantillons de grandes cellules (de l'ordre de 10 6 ~ 10 7 ). Jusqu'à 24 échantillons de chromatine cisaillée peuvent être traités pour produire un ADN prêt pour la PCR en 5 heures, ce qui permet de sonder plusieurs facteurs de chromatine simultanément et/ou d'examiner les événements génomiques sur plusieurs points dans le temps.
  • ChIP rapide et quantitative (Q 2 ChIP) : Le test utilise 100 000 cellules comme matériel de départ et convient à jusqu'à 1 000 puces d'histone ou 100 puces de facteur de transcription. Ainsi, de nombreux échantillons de chromatine peuvent être préparés en parallèle et stockés, et Q 2 ChIP peut être entrepris en une journée.
  • MicroChIP (µChIP) : la chromatine est généralement préparée à partir de 1 000 cellules et jusqu'à 8 ChIP peuvent être réalisées en parallèle sans porteurs. Le test peut également commencer avec 100 cellules, mais ne convient que pour une puce. Il peut également utiliser de petites biopsies tissulaires (1 mm 3 ) et la micropuce peut être effectuée en une journée.
  • Matrix ChIP : Il s'agit d'un test ChIP basé sur microplaque avec un débit accru et une procédure simplifiée. Toutes les étapes sont effectuées dans des puits de microplaque sans transfert d'échantillons, ce qui permet un potentiel d'automatisation. Il permet 96 tests ChIP pour les histones et diverses protéines liées à l'ADN en une seule journée.
  • Pathology-ChIP (PAT-ChIP) : Cette technique permet de ChIP à partir de tissus pathologiques fixés au formol et inclus en paraffine et donc d'utiliser des archives de pathologie (même vieilles de plusieurs années) pour des analyses épigénétiques et l'identification de biomarqueurs épigénétiques candidats ou cibles.

La puce a également été appliquée pour l'analyse à l'échelle du génome en combinant la technologie des puces à ADN ( ChIP-on-chip ) ou la technologie de séquençage de l'ADN de deuxième génération ( Chip-Sequencing ). ChIP peut également se combiner avec le séquençage de balises appariées dans l' analyse d'interaction de la chromatine à l'aide du séquençage de balises appariées (ChIA-PET), une technique développée pour l'analyse de novo à grande échelle des structures de chromatine d'ordre supérieur.

Limites

  • Les tests à grande échelle utilisant la puce ChIP sont difficiles à utiliser avec des organismes modèles intacts. En effet, des anticorps doivent être générés pour chaque TF, ou, en variante, des organismes modèles transgéniques exprimant des TF marqués par un épitope doivent être produits.
  • Les chercheurs qui étudient les modèles d'expression différentielle des gènes dans les petits organismes sont également confrontés à des problèmes, car les gènes sont exprimés à de faibles niveaux, dans un petit nombre de cellules, dans une fenêtre temporelle étroite.
  • Les expériences ChIP ne peuvent pas faire la distinction entre les différentes isoformes de TF ( Protéine isoforme ).

Voir également

  • ChIP-exo , une technique qui ajoute un traitement par exonucléase au processus ChIP pour obtenir une résolution jusqu'à une seule paire de bases de sites de liaison
  • ChIP-on-chip , combine la puce avec la technologie microarray
  • DamID , une technique de cartographie de localisation alternative qui ne nécessite pas d'anticorps spécifiques
  • RIP-Chip , une technique similaire pour analyser les interactions ARN-protéine

Les références

Liens externes