Knockout de gène conditionnel - Conditional gene knockout

Le knock - out conditionnel de gène est une technique utilisée pour éliminer un gène spécifique dans un certain tissu, tel que le foie. Cette technique est utile pour étudier le rôle des gènes individuels dans les organismes vivants. Il diffère du knock-out de gène traditionnel car il cible des gènes spécifiques à des moments spécifiques plutôt que d'être supprimé dès le début de la vie. L'utilisation de la technique de knock-out de gène conditionnel élimine de nombreux effets secondaires du knock-out de gène traditionnel . Dans le knock-out génique traditionnel, la mort embryonnaire d'une mutation génique peut survenir, ce qui empêche les scientifiques d'étudier le gène chez l'adulte. Certains tissus ne peuvent pas être étudiés correctement de manière isolée, le gène doit donc être inactif dans un certain tissu tout en restant actif dans d'autres. Grâce à cette technologie, les scientifiques sont capables d'invalider des gènes à un stade spécifique du développement et d'étudier comment l'inactivation d'un gène dans un tissu affecte le même gène dans d'autres tissus.

Technique

Diagramme montrant comment générer une souris knock-out conditionnelle : une souris contenant le gène Cre et une souris contenant le gène lox ont été sélectionnées pour générer un knock-out conditionnel pour un gène d'intérêt particulier. Les souris n'expriment pas naturellement les sites de recombinase Cre ou lox, mais elles ont été conçues pour exprimer ces produits géniques afin de créer la progéniture souhaitable.

La technique la plus couramment utilisée est le système de recombinaison Cre-lox. L'enzyme Cre recombinase reconnaît spécifiquement deux sites lox (loci de recombinaison) dans l'ADN et provoque une recombinaison entre eux. Au cours de la recombinaison, deux brins d'ADN échangent des informations. Cette recombinaison va provoquer une délétion ou une inversion des gènes entre les deux sites lox, selon leur orientation. Un gène entier peut être retiré pour l'inactiver. Tout ce système est inductible, donc un produit chimique peut être ajouté pour éliminer les gènes à un moment précis. Deux des produits chimiques les plus couramment utilisés sont la tétracycline, qui active la transcription du gène de la recombinase Cre et le tamoxifène, qui active le transport de la protéine recombinase Cre vers le noyau. Seuls quelques types de cellules expriment la recombinase Cre et aucune cellule de mammifère ne l'exprime. Comprendre comment exprimer la Cre-recombinase dans un organisme a tendance à être la partie la plus difficile de cette technique.

Les usages

La méthode de knock-out de gène conditionnel est souvent utilisée pour modéliser des maladies humaines chez d'autres mammifères. Il a augmenté la capacité des scientifiques à étudier des maladies, telles que le cancer, qui se développent dans des types cellulaires ou des stades de développement spécifiques. On sait que des mutations du gène BRCA1 sont liées au cancer du sein. Les scientifiques ont utilisé l'inactivation conditionnelle du gène pour supprimer l' allèle BRCA1 dans le tissu de la glande mammaire chez la souris et ont découvert qu'il joue un rôle important dans la suppression des tumeurs.

Un gène spécifique dans le cerveau de souris, supposé être impliqué dans l'apparition de la maladie d'Alzheimer, qui code pour l'enzyme cycline-dépendante kinase 5 (Cdk5), a été désactivé. Ces souris se sont avérées « plus intelligentes » que les souris normales et étaient capables de gérer des tâches complexes plus intelligemment que les souris « normales » élevées en laboratoire.

Projet Knockout Mouse (KOMP)

Les knock-outs de gènes conditionnels chez la souris sont souvent utilisés pour étudier les maladies humaines, car de nombreux gènes produisent des phénotypes similaires chez les deux espèces. Au cours des 100 dernières années, la génétique des souris de laboratoire a été utilisée pour cela parce que les souris sont des mammifères qui sont physiologiquement suffisamment similaires aux humains pour générer des tests qualitatifs. Ces deux-là ont des gènes si similaires que sur 4000 gènes étudiés, seulement 10 ont été trouvés dans une espèce mais pas dans l'autre. Tous les mammifères partageaient le même ancêtre commun il y a environ 80 millions d'années ; techniquement parlant, tous les génomes des mammifères sont relativement similaires. Cependant, en comparaison entre les souris et les humains, leurs régions codant pour les protéines des génomes sont identiques à 85 % et présentent des similitudes entre 99 % de leurs homologues. Ces similitudes se traduisent par des phénotypes similaires à exprimer entre les deux espèces.[8][12] Leurs gènes sont très similaires à ceux des humains avec 99% d'homologues similaires. En plus de produire des phénotypes similaires, ils en font des candidats très prometteurs pour les knock-outs de gènes conditionnels.[8] L'objectif de KOMP est de créer des mutations knock-out dans les cellules souches embryonnaires pour chacun des 20 000 gènes codant des protéines chez la souris. Les gènes sont assommés car c'est le meilleur moyen d'étudier leur fonction et d'en savoir plus sur leur rôle dans les maladies humaines. Il existe deux stratégies principales pour le knock-out génique conditionnel et celles-ci sont le ciblage génique ou la recombinaison homologue et le piégeage génique. Les deux méthodes ont généralement un vecteur viral modifié ou un fragment linéaire comme mode de transport de l'ADN artificiel dans la cellule ES cible. Les cellules se développent ensuite dans une boîte de Pétri pendant plusieurs jours et sont insérées dans les embryons à un stade précoce. Enfin, les embryons sont placés dans l'utérus de la femelle adulte où elle peut devenir sa progéniture.[9] Certains allèles de ce projet ne peuvent pas être éliminés par des méthodes traditionnelles et nécessitent la spécificité de la technique d'inactivation conditionnelle des gènes. D'autres méthodes combinatoires sont nécessaires pour éliminer les derniers allèles restants. L'inactivation conditionnelle des gènes est une procédure qui prend du temps et d'autres projets se concentrent sur l'élimination des gènes de souris restants. Le contributeur du projet KOMP, Oliver Smithies, a sans doute fourni le plus grand impact scientifique sur ce ciblage génique. Oliver a reçu le prix Nobel de médecine en raison d'une technique permettant d'identifier les fonctions des gènes et d'utiliser la méthode « knockout » pour supprimer certains gènes. Malheureusement, le pionnier du ciblage génique est décédé à l'âge de 91 ans le 10 janvier 2017.[11] Le projet KOMP a été lancé en 2006 et est toujours en cours aujourd'hui. Le référentiel KOMP offre des incitations à ceux qui participent aux projets pour leur faire part de leurs commentaires et ceux qui répondent à des critères spécifiques peuvent se voir rembourser 50% du coût de leurs cellules de recherche.[10]

Les références

8. Austin, CP, Battey, JF, Bradley, A., Bucan, M., Capecchi, M., Collins, FS, Dove, WF, Duyk, G., Dymecki, S., Eppig, JT, Grieder, FB , Heintz, N., Hicks, G., Insel, TR, Joyner, A., Koller, BH, Lloyd, KC, Magnuson, T., Moore, MW, Nagy, A., … Zambrowicz, B. (2004) . Le projet de souris knock-out. Génétique de la nature, 36(9), 921-924. https://doi.org/10.1038/ng0904-921

9. Fiche d'information sur les souris knock-out. (sd). Extrait de https://www.genome.gov/about-genomics/fact-sheets/Knockout-Mice-Fact-Sheet

10. Lloyd KC (2011). Une ressource de souris knock-out pour la communauté de la recherche biomédicale. Annales de l'Académie des sciences de New York, 1245, 24-26. https://doi.org/10.1111/j.1749-6632.2011.06311.x

11. Le lauréat du prix Nobel, le Dr Oliver Smithies, prononcera la conférence Earl H. Morris Endowed le 10 juillet. (sd). Extrait de https://medicine.wright.edu/about/article/2009/smithieslecture

12. NIH. (sd). Pourquoi la souris compte. Extrait de https://www.genome.gov/10001345/importance-of-mouse-genome