brassage d'ADN - DNA shuffling

Les mutations ponctuelles entraînent des modifications d'un seul nucléotide, tandis que les insertions et les suppressions entraînent respectivement l'ajout ou la suppression de nucléotides. Le brassage de l'ADN permet la recombinaison des gènes parents, ce qui augmente considérablement le taux d'évolution dirigée. Cette méthode est utile pour générer des protéines avec de nouvelles propriétés ou des combinaisons de propriétés souhaitées.

Le brassage d'ADN , également connu sous le nom de sélection moléculaire, est une méthode de recombinaison homologue in vitro pour propager rapidement des mutations pour une évolution dirigée . L'approche générale consiste à fragmenter les gènes parents, à permettre aux fragments de s'hybrider en fonction de l'homologie de séquence, puis à amplifier l'ADN recombiné avec la réaction en chaîne par polymérase (PCR). L'objectif est d'introduire des mutations et de créer des gènes recombinants qui permettent l'augmentation rapide de la taille de la bibliothèque d'ADN.

Le réarrangement d'ADN utilise la recombinaison aléatoire par opposition à la mutagenèse dirigée afin de générer des protéines avec des attributs uniques ou des combinaisons de caractéristiques souhaitables codées dans les gènes parents tels que la thermostabilité et une activité élevée.

En 1994, Willem PC Stemmer a publié un article sur le remaniement de l'ADN pour éliminer les mutations non essentielles du gène de la β-lactamase et a pu augmenter la production de l'antibiotique céfotaxime . Depuis l'introduction de la technique, le brassage de l'ADN a été appliqué aux produits pharmaceutiques à base de protéines et de petites molécules, aux vaccins, à la thérapie génique et aux virus évolués. D'autres techniques qui donnent des résultats similaires au réarrangement de l'ADN comprennent la chiméragenèse aléatoire sur des modèles transitoires, l'impression aléatoire, la recombinaison in vitro et le processus d'extension échelonné .  

Histoire

Cette technique a été signalée pour la première fois en 1994 par Willem PC Stemmer. Il a commencé par fragmenter le gène de la β-lactamase qui avait été amplifié par PCR en utilisant la DNase I . Il a ensuite terminé une réaction de PCR modifiée où les amorces n'ont pas été utilisées, ce qui a entraîné l'annelage de fragments homologues. Enfin, ces fragments ont été amplifiés par PCR. Stemmer a rapporté que l'utilisation du réarrangement de l'ADN en combinaison avec le rétrocroisement a entraîné l'élimination des mutations non essentielles et une augmentation de la production de l'antibiotique céfotaxime. Il a également souligné le potentiel d'évolution moléculaire avec le brassage de l'ADN. Plus précisément, il a indiqué que la technique pourrait être utilisée pour modifier les protéines.   

Le brassage d'ADN a depuis été appliqué pour générer des bibliothèques de gènes chimériques et a inspiré le brassage familial qui est défini comme l'utilisation de gènes apparentés dans le brassage d'ADN. De plus, cette méthode de recombinaison homologue a été appliquée aux produits pharmaceutiques à base de protéines et de petites molécules, à la thérapie génique, aux vaccins et aux virus évolués.

Procédure

Sélection moléculaire

Premièrement, la DNase I est utilisée pour fragmenter un ensemble de gènes parents en segments allant de 10 à 50 pb à plus de 1 kpb. Ceci est suivi d'une PCR sans amorces. Dans la PCR, les fragments d'ADN avec suffisamment de séquences homologues se chevauchant s'hybrideront les uns aux autres puis seront étendus par l' ADN polymérase . L'extension PCR ne se produira pas à moins qu'il n'y ait des séquences d'ADN de haute similarité. Les facteurs importants influençant les séquences chimériques synthétisées dans le réarrangement d'ADN sont l'ADN polymérase, les concentrations de sel et la température d'hybridation. Par exemple, l'utilisation de la Taq polymérase pour l'amplification d'un fragment de 1 kpb dans une PCR de 20 cycles conduit à 33 % à 98 % des produits contenant une ou plusieurs mutations.

Plusieurs cycles d'extension PCR peuvent être utilisés pour amplifier les fragments. L'ajout d'amorces conçues pour être complémentaires aux extrémités des fragments étendus est ajouté pour amplifier davantage les séquences avec une autre PCR. Les amorces peuvent être choisies pour avoir des séquences supplémentaires ajoutées à leurs extrémités 5', telles que des séquences pour les sites de reconnaissance d' enzymes de restriction nécessaires pour la ligature dans un vecteur de clonage .

Il est possible de recombiner des portions des gènes parents pour générer des hybrides ou des formes chimériques aux propriétés uniques, d'où le terme de réarrangement d'ADN.

Les enzymes de restriction

Des enzymes de restriction sont utilisées pour fragmenter les gènes parents. Les fragments sont ensuite réunis par ligature qui peut être réalisée avec de l' ADN ligase . Par exemple, si deux gènes parents ont trois sites de restriction, quatorze hybrides de gènes différents peuvent être créés.

Recombinaison aléatoire non homologue

Afin de générer des segments allant de 10 à 50 pb à plus de 1 kb, la DNase I est utilisée. Les extrémités des fragments sont rendues franches par addition d'ADN polymérase T4. Une épingle à cheveux avec un site de restriction spécifique est ensuite ajoutée au mélange de fragments. Ensuite, l'ADN ligase T4 est utilisée pour ligaturer les fragments pour former des séquences étendues. Enfin, afin d'éliminer les boucles en épingle à cheveux, une enzyme de restriction est utilisée.

Applications

Produits pharmaceutiques à base de protéines et de petites molécules

Étant donné que le réarrangement de l'ADN permet la recombinaison des gènes, les activités des protéines peuvent être améliorées. Par exemple, le brassage d'ADN a été utilisé pour augmenter la puissance des recombinants présentés sur phage sur des cellules murines et humaines. La synthèse de divers gènes peut également entraîner la production de protéines avec de nouveaux attributs. La dégradation des polluants biologiques par des protéines dérivées du brassage d'ADN a été accomplie. Un exemple est le développement d'une souche d'E. coli recombinante avec réarrangement d'ADN pour la biorestauration du trichloroéthylène qui est moins sensible aux intermédiaires époxydes toxiques. Un autre exemple est l'amélioration de la protéine fluorescente verte (GFP) où le brassage d'ADN a été utilisé pour générer un signal 45 fois supérieur à la norme pour la fluorescence de cellules entières. En outre, la méthode de recombinaison homologue de réarrangement de l'ADN a été utilisée pour améliorer la détoxification de l' atrazine et de l' arséniate .  

Vaccins

La capacité de sélectionner des recombinants souhaitables avec le brassage de l'ADN a été utilisée en combinaison avec des stratégies de criblage pour améliorer les vaccins candidats contre les infections en mettant l'accent sur l'amélioration de l' immunogénicité , la production de vaccins, la stabilité et la réactivité croisée avec plusieurs souches d'agents pathogènes. Certains vaccins candidats contre Plasmodium falciparum , le virus de la dengue , les alphavirus encéphalitiques (notamment : VEEV , WEEV et EEEV ), le virus de l'immunodéficience humaine-1 (VIH-1) et le virus de l'hépatite B (VHB) ont été étudiés.   

Thérapie génique et virus évolués

Les exigences des thérapies géniques humaines comprennent une pureté élevée, une immunité (titre élevé) et une stabilité. Le brassage d'ADN permet la fabrication de vecteurs rétroviraux avec ces attributs. Par exemple, cette technique a été appliquée à six souches de virus de la leucémie murine écotrope (MLV) qui ont abouti à la compilation d'une vaste bibliothèque de rétrovirus recombinants et à l'identification de plusieurs clones avec une stabilité accrue. En outre, l'application de l'ADN-shuffling sur plusieurs vecteurs parentaux de virus adéno-associés (AAV) a été utilisée pour générer une bibliothèque de dix millions de chimères. Les attributs avantageux obtenus comprennent une résistance accrue à l'immunoglobuline intraveineuse humaine (IVIG) et la production de tropisme cellulaire dans les nouveaux virus.   

Voir également

Les références

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