Dégradation d'Edman - Edman degradation
La dégradation d'Edman , développée par Pehr Edman , est une méthode de séquençage d' acides aminés dans un peptide . Dans ce procédé, le résidu amino-terminal est marqué et clivé du peptide sans interrompre les liaisons peptidiques entre les autres résidus d'acides aminés.
Mécanisme
L'isothiocyanate de phényle est mis à réagir avec un groupe amino N-terminal non chargé, dans des conditions légèrement alcalines, pour former un dérivé de phénylthiocarbamoyle cyclique . Ensuite, dans des conditions acides , ce dérivé de l'acide aminé terminal est clivé sous forme d'un dérivé de thiazolinone. L'acide aminé thiazolinone est ensuite extrait sélectivement dans un solvant organique et traité avec un acide pour former le dérivé d'acide aminé phénylthiohydantoïne (PTH) plus stable qui peut être identifié par chromatographie ou électrophorèse . Cette procédure peut ensuite être répétée à nouveau pour identifier le prochain acide aminé. Un inconvénient majeur de cette technique est que les peptides séquencés de cette manière ne peuvent pas avoir plus de 50 à 60 résidus (et en pratique, moins de 30). La longueur du peptide est limitée en raison de la dérivatisation cyclique qui ne va pas toujours jusqu'à son terme. Le problème de dérivatisation peut être résolu en clivant de gros peptides en peptides plus petits avant de procéder à la réaction. Il est capable de séquencer avec précision jusqu'à 30 acides aminés avec des machines modernes capables d'une efficacité de plus de 99% par acide aminé . Un avantage de la dégradation d'Edman est qu'elle n'utilise que 10 à 100 pico-moles de peptide pour le processus de séquençage. La réaction de dégradation d'Edman a été automatisée en 1967 par Edman et Beggs pour accélérer le processus et 100 appareils automatisés étaient utilisés dans le monde en 1973.
Limites
Etant donné que la dégradation d'Edman provient de l'extrémité N-terminale de la protéine, elle ne fonctionnera pas si l'extrémité N-terminale a été chimiquement modifiée (par exemple par acétylation ou formation d' acide pyroglutamique ). Le séquençage s'arrêtera si un acide non-a-aminé est rencontré (par exemple l' acide isoaspartique ), puisque l'intermédiaire de cycle à cinq chaînons préféré ne peut pas être formé. La dégradation d'Edman n'est généralement pas utile pour déterminer les positions des ponts disulfure. Il nécessite également des quantités de peptide de 1 picomole ou plus pour des résultats discernables.
Analyse couplée
Après SDS PAGE 2D, les protéines peuvent être transférées sur une membrane de transfert de difluorure de polyvinylidène (PVDF) pour une analyse plus approfondie. Les dégradations d'Edman peuvent être effectuées directement à partir d'une membrane PVDF. Le séquençage des résidus N-terminaux aboutissant à cinq à dix acides aminés peut être suffisant pour identifier une protéine d'intérêt (POI).