Précipitation à l'éthanol - Ethanol precipitation

La précipitation à l'éthanol est une méthode utilisée pour purifier et / ou concentrer l' ARN , l' ADN et les polysaccharides tels que la pectine et le xyloglucane à partir de solutions aqueuses en ajoutant de l' éthanol comme antisolvant.

Précipitation d'ADN

Théorie

La première coquille d'hydratation d'un ion sodium dissous dans l'eau

L'ADN est polaire en raison de son squelette phosphate hautement chargé . Sa polarité le rend soluble dans l'eau (l'eau est polaire) selon le principe «comme se dissout comme» .

En raison de la polarité élevée de l'eau, illustrée par sa constante diélectrique élevée de 80,1 (à 20 ° C), les forces électrostatiques entre particules chargées sont considérablement plus faibles en solution aqueuse qu'elles ne le sont dans le vide ou dans l'air.

Cette relation se traduit par la loi de Coulomb , qui peut être utilisée pour calculer la force agissant sur deux charges et séparées par une distance à l'aide de la constante diélectrique (également appelée permittivité statique relative) du milieu dans le dénominateur de l'équation ( est un électrique constante ): ${\ displaystyle q_ {1}}$${\ displaystyle q_ {2}}$${\ displaystyle r}$${\ displaystyle \ varepsilon _ {r}}$${\ displaystyle \ varepsilon _ {0}}$

${\ displaystyle F = {\ frac {1} {4 \ pi \ varepsilon _ {r} \ varepsilon _ {0}}} {\ frac {q_ {1} q_ {2}} {r ^ {2}}} }$

Au niveau atomique, la réduction de la force agissant sur une charge résulte du fait que les molécules d'eau forment une coquille d'hydratation autour d'elle. Ce fait fait de l'eau un très bon solvant pour les composés chargés comme les sels. La force électrique qui maintient normalement les cristaux de sel ensemble au moyen de liaisons ioniques est affaiblie en présence d'eau, ce qui permet aux ions de se séparer du cristal et de se répandre dans la solution.

Le même mécanisme fonctionne dans le cas de groupes phosphate chargés négativement sur un squelette d'ADN: même si des ions positifs sont présents en solution, la force électrostatique nette relativement faible les empêche de former des liaisons ioniques stables avec les phosphates et de précipiter hors de la solution.

L'éthanol est beaucoup moins polaire que l'eau, avec une constante diélectrique de 24,3 (à 25 ° C). Cela signifie que l'ajout d'éthanol à la solution perturbe le filtrage des charges par l'eau. Si suffisamment d'éthanol est ajouté, l'attraction électrique entre les groupes phosphate et tous les ions positifs présents en solution devient suffisamment forte pour former des liaisons ioniques stables et une précipitation de l'ADN. Cela se produit généralement lorsque l'éthanol compose plus de 64% de la solution. Comme le mécanisme le suggère, la solution doit contenir des ions positifs pour que la précipitation se produise; généralement Na ⁺ , NH ₄ ⁺ ou Li ⁺ joue ce rôle.

Entraine toi

Une centrifugeuse de table de laboratoire

L'ADN est précipité en s'assurant d'abord que la concentration correcte d'ions positifs est présente dans la solution (trop de sel entraînera une co-précipitation de sel avec l'ADN, trop peu entraînera une récupération incomplète de l'ADN), puis en ajoutant deux à trois volumes de au moins 95% d'éthanol. De nombreux protocoles conseillent de stocker l'ADN à basse température à ce stade, mais il existe également des observations selon lesquelles cela peut ne pas améliorer la récupération de l'ADN et peut même réduire l'efficacité des précipitations tout en utilisant un temps d'incubation nocturne. Par conséquent, une bonne efficacité peut être obtenue à température ambiante, mais lorsque la dégradation possible est prise en compte, il est probablement préférable d'incuber l'ADN sur de la glace humide. Le temps d'incubation optimal dépend de la longueur et de la concentration d'ADN. Des fragments plus petits et des concentrations plus faibles nécessiteront des temps plus longs pour obtenir une récupération acceptable. Pour de très petites longueurs et de faibles concentrations, une incubation nocturne est recommandée. Dans de tels cas, l'utilisation de supports comme l' ARNt , le glycogène ou le polyacrylamide linéaire peut grandement améliorer la récupération.

Pendant l'incubation, l'ADN et certains sels précipiteront de la solution, à l'étape suivante, ce précipité est recueilli par centrifugation dans un tube de microcentrifugeuse à des vitesses élevées (~ 12 000 g ). Le temps et la vitesse de centrifugation ont le plus grand effet sur les taux de récupération d'ADN. Là encore, des fragments plus petits et des dilutions plus élevées nécessitent une centrifugation plus longue et plus rapide. La centrifugation peut être effectuée soit à température ambiante, soit à 4 ° C ou 0 ° C. Pendant la centrifugation, l'ADN précipité doit se déplacer à travers la solution d'éthanol jusqu'au fond du tube, des températures plus basses augmentent la viscosité de la solution et des volumes plus importants allongent la distance, de sorte que ces deux facteurs réduisent l'efficacité de ce processus nécessitant une centrifugation plus longue pour le même effet. Après centrifugation, la solution de surnageant est éliminée, laissant un culot d'ADN brut. La visibilité du culot dépend de la quantité d'ADN et de sa pureté (les granules plus sales sont plus faciles à voir) ou de l'utilisation de co-précipitants.

Dans l'étape suivante, 70% d'éthanol est ajouté au culot, et il est mélangé doucement pour casser le culot et le laver. Cela supprime certains des sels présents dans le surnageant restant et liés au culot d'ADN, ce qui rend le nettoyant d'ADN final. Cette suspension est à nouveau centrifugée pour culoter à nouveau l'ADN et la solution surnageante est éliminée. Cette étape est répétée une fois.

Enfin, le culot est séché à l'air et l'ADN est remis en suspension dans l'eau ou un autre tampon souhaité . Il est important de ne pas trop sécher le culot car cela peut entraîner une dénaturation de l'ADN et rendre sa remise en suspension plus difficile.

L'isopropanol peut également être utilisé à la place de l'éthanol; l'efficacité de précipitation de l'isopropanol est plus élevée, ce qui donne un volume suffisant pour la précipitation. Cependant, l'isopropanol est moins volatil que l'éthanol et a besoin de plus de temps pour sécher à l'air dans l'étape finale. Le culot peut également adhérer moins étroitement au tube lors de l'utilisation d'isopropanol.

Voir également

• Extraction d'ADN
• Extraction phénol-chloroforme
• Saler
• Salage
• Purification de l'ADN SCODA
• Purification des acides nucléiques à base de colonne de spin

Les références

Liens externes

• bitesizebio.com Les bases: comment fonctionne la précipitation par l'éthanol de l'ADN et de l'ARN
• Le juge Zeugin, Hartley JL (1985). "Précipitation d'ADN par l'éthanol" (PDF) . Concentrez-vous . 7 (4): 1–2 . Récupéré le 10/09/2008 .
• Crouse J, Amorese D (1987). "Précipitation d'éthanol: l'acétate d'ammonium comme alternative à l'acétate de sodium" (PDF) . Concentrez-vous . 9 (2): 3–5. Archivé de l'original (PDF) le 2009-11-22 . Récupéré le 10/09/2008 .