Hybridation in situ en fluorescence -Fluorescence in situ hybridization

Visualisation de l'ARN multiplex dans les cellules à l'aide des tests ViewRNA FISH
Une cellule en métaphase positive pour le réarrangement bcr/abl (associé à la leucémie myéloïde chronique ) en utilisant FISH. Les chromosomes peuvent être vus en bleu. Le chromosome marqué de points verts et rouges (en haut à gauche) est celui où le réarrangement est présent.

L' hybridation in situ par fluorescence ( FISH ) est une technique de cytogénétique moléculaire qui utilise des sondes fluorescentes qui ne se lient qu'à des parties particulières d'une séquence d'acide nucléique avec un degré élevé de complémentarité de séquence . Il a été développé par des chercheurs biomédicaux au début des années 1980 pour détecter et localiser la présence ou l'absence de séquences d' ADN spécifiques sur les chromosomes . La microscopie à fluorescence peut être utilisée pour découvrir où la sonde fluorescente est liée aux chromosomes. FISH est souvent utilisé pour trouver des caractéristiques spécifiques dans l'ADN à utiliser dans le conseil génétique , la médecine et l'identification des espèces. FISH peut également être utilisé pour détecter et localiser des cibles d'ARN spécifiques ( ARNm , lncRNA et miARN ) dans les cellules, les cellules tumorales circulantes et les échantillons de tissus. Dans ce contexte, il peut aider à définir les modèles spatio-temporels de l'expression des gènes dans les cellules et les tissus.

Sondes – ARN et ADN

Détection ViewRNA de miR-133 (vert) et d'ARNm de myogénine (rouge) dans les cellules de différenciation C2C12

En biologie, une sonde est un simple brin d'ADN ou d'ARN complémentaire d'une séquence nucléotidique d'intérêt.

Les sondes d'ARN peuvent être conçues pour n'importe quel gène ou n'importe quelle séquence au sein d'un gène pour la visualisation d' ARNm , d' ARNlnc et de miARN dans les tissus et les cellules. FISH est utilisé en examinant le cycle de reproduction cellulaire, en particulier l'interphase des noyaux pour toute anomalie chromosomique. FISH permet l'analyse d'une grande série de cas d'archives beaucoup plus facile d'identifier le chromosome localisé en créant une sonde avec une base chromosomique artificielle qui attirera des chromosomes similaires. L'hybridation signale pour chaque sonde lorsqu'une anomalie nucléique est détectée. Chaque sonde pour la détection d'ARNm et d'ARNlnc est composée d'environ 20 à 50 paires d'oligonucléotides, chaque paire couvrant un espace de 40 à 50 pb. Les spécificités dépendent de la technique FISH utilisée. Pour la détection des miARN, les sondes utilisent une chimie exclusive pour la détection spécifique des miARN et couvrent l'intégralité de la séquence des miARN.

Cellules urothéliales marquées avec quatre sondes différentes

Les sondes sont souvent dérivées de fragments d'ADN qui ont été isolés, purifiés et amplifiés pour être utilisés dans le projet du génome humain . La taille du génome humain est si grande, comparée à la longueur qui pourrait être séquencée directement, qu'il a été nécessaire de diviser le génome en fragments. (Dans l'analyse finale, ces fragments ont été mis en ordre en digérant une copie de chaque fragment en fragments encore plus petits à l'aide d'endonucléases spécifiques à la séquence, en mesurant la taille de chaque petit fragment à l'aide de la chromatographie d'exclusion de taille et en utilisant ces informations pour déterminer où le de grands fragments se chevauchaient.) Pour préserver les fragments avec leurs séquences d'ADN individuelles, les fragments ont été ajoutés dans un système de populations bactériennes en réplication continue. Des populations clonales de bactéries, chaque population conservant un seul chromosome artificiel, sont stockées dans divers laboratoires à travers le monde. Les chromosomes artificiels ( BAC ) peuvent être cultivés, extraits et étiquetés dans n'importe quel laboratoire contenant une bibliothèque. Les bibliothèques génomiques portent souvent le nom de l'institution dans laquelle elles ont été développées. Un exemple étant la bibliothèque RPCI-11, qui porte le nom du Roswell Park Comprehensive Cancer Center (anciennement connu sous le nom de Roswell Park Cancer Institute) à Buffalo, New York . Ces fragments sont de l'ordre de 100 000 paires de bases et constituent la base de la plupart des sondes FISH.

Processus de préparation et d'hybridation – ARN

Les cellules, les cellules tumorales circulantes (CTC) ou les coupes de tissus en paraffine fixées au formol (FFPE) ou congelées sont fixées, puis perméabilisées pour permettre l'accessibilité de la cible. FISH a également été réalisé avec succès sur des cellules non fixées. Une sonde spécifique à la cible, composée de 20 paires d'oligonucléotides, s'hybride au(x) ARN cible(s). Des systèmes d'amplification de signal séparés mais compatibles permettent le dosage multiplex (jusqu'à deux cibles par dosage). L'amplification du signal est réalisée via une série d'étapes d'hybridation séquentielles. A la fin du dosage, les échantillons de tissus sont visualisés sous un microscope à fluorescence.

Processus de préparation et d'hybridation – ADN

Schéma du principe de l'Expérience FISH pour localiser un gène dans le noyau.

Tout d'abord, une sonde est construite. La sonde doit être suffisamment grande pour s'hybrider spécifiquement avec sa cible mais pas assez grande pour empêcher le processus d'hybridation. La sonde est marquée directement avec des fluorophores , avec des cibles d' anticorps ou avec de la biotine . Le marquage peut être effectué de différentes manières, telles que la translation de coupure ou la réaction en chaîne de la polymérase à l' aide de nucléotides marqués .

Ensuite, une préparation chromosomique en interphase ou en métaphase est réalisée. Les chromosomes sont fermement attachés à un substrat , généralement du verre. Les séquences d'ADN répétitives doivent être bloquées en ajoutant de courts fragments d'ADN à l'échantillon. La sonde est ensuite appliquée sur l'ADN chromosomique et incubée pendant environ 12 heures tout en s'hybridant. Plusieurs étapes de lavage éliminent toutes les sondes non hybridées ou partiellement hybridées. Les résultats sont ensuite visualisés et quantifiés à l'aide d'un microscope capable d'exciter le colorant et d'enregistrer des images.

Si le signal fluorescent est faible, une amplification du signal peut être nécessaire afin de dépasser le seuil de détection du microscope . La force du signal fluorescent dépend de nombreux facteurs tels que l'efficacité de marquage de la sonde, le type de sonde et le type de colorant. Des anticorps marqués par fluorescence ou de la streptavidine sont liés à la molécule de colorant. Ces composants secondaires sont sélectionnés de manière à avoir un signal fort.

Variations sur les sondes et l'analyse

Le FISH est une technique très générale. Les différences entre les différentes techniques FISH sont généralement dues à des variations dans la séquence et le marquage des sondes ; et comment ils sont utilisés en combinaison. Les sondes sont divisées en deux catégories génériques : cellulaires et acellulaires. En fluorescence, l'hybridation "in situ" fait référence au placement cellulaire de la sonde

La taille de la sonde est importante car les sondes plus longues s'hybrident moins spécifiquement que les sondes plus courtes, de sorte que de courts brins d'ADN ou d'ARN (souvent de 10 à 25 nucléotides) qui sont complémentaires à une séquence cible donnée sont souvent utilisés pour localiser une cible. Le chevauchement définit la résolution des caractéristiques détectables. Par exemple, si le but d'une expérience est de détecter le point de rupture d'une translocation , alors le chevauchement des sondes - le degré auquel une séquence d'ADN est contenue dans les sondes adjacentes - définit la fenêtre minimale dans laquelle le point de rupture peut être détecté .

Le mélange de séquences de sonde détermine le type de caractéristique que la sonde peut détecter. Les sondes qui s'hybrident le long d'un chromosome entier sont utilisées pour compter le nombre d'un certain chromosome, montrer des translocations ou identifier des fragments extra-chromosomiques de chromatine . C'est ce qu'on appelle souvent la "peinture du chromosome entier". Si toutes les sondes possibles sont utilisées, chaque chromosome (le génome entier) serait marqué par fluorescence, ce qui ne serait pas particulièrement utile pour déterminer les caractéristiques des séquences individuelles. Cependant, il est possible de créer un mélange de sondes plus petites qui sont spécifiques à une région particulière (locus) de l'ADN ; ces mélanges sont utilisés pour détecter les mutations par délétion . Lorsqu'il est associé à une couleur spécifique, un mélange de sondes spécifiques au locus est utilisé pour détecter des translocations très spécifiques. Des mélanges de sondes spécifiques à des locus spéciaux sont souvent utilisés pour compter les chromosomes, en se liant aux régions centromériques des chromosomes, qui sont suffisamment distinctives pour identifier chaque chromosome (à l'exception des chromosomes 13 , 14 , 21 , 22. )

Diverses autres techniques utilisent des mélanges de sondes de couleurs différentes. Une gamme de couleurs dans des mélanges de colorants fluorescents peut être détectée, de sorte que chaque chromosome humain peut être identifié par une couleur caractéristique en utilisant des mélanges de sondes de chromosomes entiers et une variété de rapports de couleurs. Bien qu'il y ait plus de chromosomes que de couleurs de colorant fluorescent facilement distinguables, des rapports de mélanges de sondes peuvent être utilisés pour créer des couleurs secondaires . Semblable à l'hybridation génomique comparative , le mélange de sondes pour les couleurs secondaires est créé en mélangeant le rapport correct de deux ensembles de sondes de couleurs différentes pour le même chromosome. Cette technique est parfois appelée M-FISH.

La même physique qui permet une variété de couleurs pour M-FISH peut être utilisée pour la détection de translocations. C'est-à-dire que les couleurs adjacentes semblent se chevaucher ; une couleur secondaire est observée. Certains dosages sont conçus de manière à ce que la couleur secondaire soit présente ou absente dans les cas intéressants. Un exemple est la détection des translocations BCR/ABL , où la couleur secondaire indique la maladie. Cette variation est souvent appelée FISH à double fusion ou D-FISH. Dans la situation inverse - où l'absence de la couleur secondaire est pathologique - est illustrée par un essai utilisé pour étudier les translocations où un seul des points de rupture est connu ou constant. Des sondes spécifiques au locus sont réalisées pour un côté du point de cassure et l'autre côté du chromosome intact. Dans les cellules normales, la couleur secondaire est observée, mais seules les couleurs primaires sont observées lors de la translocation. Cette technique est parfois appelée « POISSON démembré ».

FISH à ARN monomoléculaire

L'ARN FISH à molécule unique, également connu sous le nom de Stellaris® RNA FISH, est une méthode de détection et de quantification de l'ARNm et d'autres molécules d'ARN longues dans une fine couche d'échantillon de tissu. Les cibles peuvent être imagées de manière fiable grâce à l'application de plusieurs courtes sondes oligonucléotidiques marquées individuellement . La liaison de jusqu'à 48 oligos marqués fluorescents à une seule molécule d'ARNm fournit une fluorescence suffisante pour détecter et localiser avec précision chaque ARNm cible dans une image de microscopie à fluorescence à grand champ . Les sondes ne se liant pas à la séquence voulue n'atteignent pas une fluorescence localisée suffisante pour être distinguée du bruit de fond .

Les dosages d'ARN FISH à molécule unique peuvent être effectués en simplex ou en multiplex , et peuvent être utilisés comme expérience de suivi d' une PCR quantitative , ou imagés simultanément avec un dosage d' anticorps fluorescents . La technologie a des applications potentielles dans le diagnostic du cancer , les neurosciences , l' analyse de l' expression génique et les diagnostics compagnons .

Fibre POISSON

Dans une technique alternative aux préparations d' interphase ou de métaphase, la fibre FISH, les chromosomes d'interphase sont attachés à une lame de telle sorte qu'ils soient étirés en ligne droite, plutôt que d'être étroitement enroulés, comme dans le FISH conventionnel, ou en adoptant un territoire chromosomique conformation, comme dans l'interphase FISH. Ceci est accompli en appliquant un cisaillement mécanique le long de la lame, soit sur des cellules qui ont été fixées sur la lame puis lysées , soit sur une solution d'ADN purifié. Une technique connue sous le nom de peignage chromosomique est de plus en plus utilisée à cette fin. La conformation étendue des chromosomes permet une résolution considérablement plus élevée, même jusqu'à quelques kilobases . La préparation d'échantillons de fibres FISH, bien que conceptuellement simple, est un art plutôt qualifié, et seuls des laboratoires spécialisés utilisent cette technique en routine.

Q-FISH

Article principal : Q-FISH

Q-FISH combine FISH avec des PNA et un logiciel informatique pour quantifier l'intensité de la fluorescence. Cette technique est couramment utilisée dans la recherche sur la longueur des télomères .

Flow-FISH

Article principal: Flow-FISH

Flow-FISH utilise la cytométrie en flux pour effectuer automatiquement la FISH à l'aide de mesures de fluorescence par cellule.

MA-POISSONS

FISH assisté par microfluidique ( MA-FISH ) utilise un flux microfluidique pour augmenter l'efficacité de l'hybridation de l'ADN, réduire la consommation coûteuse de sondes FISH et réduire le temps d'hybridation. MA-FISH est utilisé pour détecter le gène HER2 dans les tissus du cancer du sein.

MAR-POISSONS

La microautoradiographie FISH est une technique permettant de combiner des substrats radiomarqués avec des FISH classiques pour détecter simultanément des groupes phylogénétiques et des activités métaboliques.

Hybride Fusion-FISH

Hybrid Fusion FISH ( HF-FISH ) utilise une combinaison primaire d'excitation/émission additive de fluorophores pour générer des spectres supplémentaires grâce à un processus de marquage connu sous le nom de transmission optique dynamique (DOT). Trois fluorophores primaires sont capables de générer un total de 7 spectres d'émission facilement détectables à la suite d'un marquage combinatoire utilisant le DOT. Hybrid Fusion FISH permet des applications FISH hautement multiplexées qui sont ciblées dans les panels d'oncologie clinique. La technologie offre une notation plus rapide avec des ensembles de sondes efficaces qui peuvent être facilement détectés avec des microscopes à fluorescence traditionnels.

Applications médicales

Souvent, les parents d'enfants ayant une déficience intellectuelle veulent en savoir plus sur l'état de leur enfant avant de choisir d'avoir un autre enfant. Ces problèmes peuvent être résolus par l'analyse de l'ADN des parents et de l'enfant. Dans les cas où le trouble du développement de l'enfant n'est pas compris, la cause peut potentiellement être déterminée à l'aide de FISH et de techniques cytogénétiques . Les exemples de maladies diagnostiquées à l'aide de FISH comprennent le syndrome de Prader-Willi , le syndrome d'Angelman , le syndrome de délétion 22q13 , la leucémie myéloïde chronique , la leucémie lymphoblastique aiguë , le Cri-du-chat , le syndrome vélocardio - facial et le syndrome de Down . FISH sur spermatozoïdes est indiqué pour les hommes présentant un caryotype somatique ou méiotique anormal ainsi que ceux présentant une oligozoospermie , car environ 50% des hommes oligozoospermiques présentent un taux accru d'anomalies chromosomiques du sperme. L'analyse des chromosomes 21, X et Y est suffisante pour identifier les individus oligozoospermiques à risque.

En médecine, FISH peut être utilisé pour établir un diagnostic , pour évaluer le pronostic ou pour évaluer la rémission d'une maladie, comme le cancer . Le traitement peut alors être spécifiquement adapté. Un examen traditionnel impliquant une analyse chromosomique en métaphase est souvent incapable d'identifier les caractéristiques qui distinguent une maladie d'une autre, en raison de caractéristiques chromosomiques subtiles ; FISH peut élucider ces différences. FISH peut également être utilisé pour détecter les cellules malades plus facilement que les méthodes cytogénétiques standard , qui nécessitent la division des cellules et nécessitent une préparation et une analyse manuelles des lames par un technologue. FISH, en revanche, ne nécessite pas de cellules vivantes et peut être quantifié automatiquement, un ordinateur compte les points fluorescents présents. Cependant, un technicien qualifié est nécessaire pour distinguer les différences subtiles dans les motifs de bandes sur les chromosomes en métaphase courbés et tordus. FISH peut être incorporé dans un dispositif microfluidique Lab-on-a-chip . Cette technologie est encore au stade de développement mais, comme d'autres méthodes de laboratoire sur puce, elle peut conduire à des techniques de diagnostic plus portables.

Cette figure décrit le processus d'hybridation fluorescente in situ (FISH) utilisé pour l'identification des agents pathogènes. Tout d'abord, un échantillon du tissu infecté est prélevé sur le patient. Ensuite, un oligonucléotide complémentaire du code génétique du pathogène suspecté est synthétisé et marqué chimiquement avec une sonde fluorescente. L'échantillon de tissu collecté doit ensuite être traité chimiquement afin de rendre les membranes cellulaires perméables à l'oligonucléotide marqué par fluorescence. Une fois l'échantillon de tissu traité, l'oligonucléotide complémentaire marqué est ajouté. L'oligonucléotide marqué par fluorescence ne se liera qu'à l'ADN complémentaire de l'agent pathogène suspecté. Si l'agent pathogène est présent dans l'échantillon de tissu, alors les cellules de l'agent pathogène brilleront/fluoreront après le traitement avec l'oligonucléotide marqué. Toutes les autres cellules ne brilleront pas après le traitement.
Procédé général d'hybridation fluorescente in situ (FISH) utilisé pour l'identification d'agents pathogènes bactériens. Tout d'abord, un échantillon de tissu infecté est prélevé sur le patient. Ensuite, un oligonucléotide complémentaire du code génétique du pathogène suspecté est synthétisé et marqué chimiquement avec une sonde fluorescente. L'échantillon de tissu est traité chimiquement afin de rendre les membranes cellulaires perméables à l'oligonucléotide marqué par fluorescence. Le marqueur fluorescent est ensuite ajouté et ne se lie qu'à l'ADN complémentaire de l'agent pathogène suspecté. Si l'agent pathogène est présent dans l'échantillon de tissu, les cellules de l'agent pathogène deviendront fluorescentes après traitement avec l'oligonucléotide marqué. Aucune autre cellule ne brillera.

Identification des espèces

FISH a été largement étudié en tant que technique de diagnostic pour l'identification d'agents pathogènes dans le domaine de la microbiologie médicale. Bien qu'il ait été prouvé qu'il s'agit d'une technique utile et applicable, elle n'est toujours pas largement appliquée dans les laboratoires de diagnostic. Le court délai de diagnostic (moins de 2 heures) a été un avantage majeur par rapport à la différenciation biochimique, mais cet avantage est remis en cause par MALDI-TOF-MS qui permet l'identification d'une plus large gamme d'agents pathogènes par rapport aux techniques de différenciation biochimique. L'utilisation de FISH à des fins de diagnostic a trouvé son utilité lorsque l'identification immédiate des espèces est nécessaire, en particulier pour l'étude des hémocultures pour lesquelles FISH est une technique peu coûteuse et facile pour un diagnostic rapide préliminaire.

FISH peut également être utilisé pour comparer les génomes de deux espèces biologiques , pour en déduire des relations évolutives . Une technique d'hybridation similaire est appelée zoo blot . Les sondes FISH bactériennes sont souvent des amorces pour la région d' ARNr 16s .

FISH est largement utilisé dans le domaine de l' écologie microbienne , pour identifier les micro-organismes . Les biofilms , par exemple, sont composés d'organisations bactériennes complexes (souvent) multi-espèces. La préparation de sondes d'ADN pour une espèce et la réalisation de FISH avec cette sonde permettent de visualiser la distribution de cette espèce spécifique au sein du biofilm. La préparation de sondes (de deux couleurs différentes) pour deux espèces permet aux chercheurs de visualiser/étudier la colocalisation de ces deux espèces dans le biofilm et peut être utile pour déterminer l'architecture fine du biofilm.

Hybridation génomique comparative

L'hybridation génomique comparative peut être décrite comme une méthode qui utilise FISH de manière parallèle avec la comparaison de la force d'hybridation pour rappeler d'éventuelles perturbations majeures dans le processus de duplication des séquences d'ADN dans le génome du noyau.

Caryotype virtuel

Le caryotypage virtuel est une autre alternative rentable et cliniquement disponible aux panels FISH utilisant des milliers à des millions de sondes sur une seule puce pour détecter les changements de nombre de copies, à l'échelle du génome, à une résolution sans précédent. Actuellement, ce type d'analyse ne détectera que les gains et les pertes de matériel chromosomique et ne détectera pas les réarrangements équilibrés, tels que les translocations et les inversions qui sont des aberrations caractéristiques observées dans de nombreux types de leucémie et de lymphome.

Caryotype spectral

Le caryotypage spectral est une image de chromosomes colorés. Le caryotypage spectral implique FISH utilisant plusieurs formes de nombreux types de sondes avec pour résultat de voir chaque chromosome marqué à travers son stade de métaphase. Ce type de caryotypage est utilisé spécifiquement lors de la recherche d'arrangements chromosomiques.

Voir également

Galerie

  • Un autre schéma du processus FISH.

  • Puce microfluidique qui a réduit le coût par test de FISH de 90 %.

  • Image FISH à double étiquette ; Bifidobactéries Cy3, Bactéries totales FITC.

  • Paraspeckles visualisés par FISH à molécule unique contre NEAT1 (Quasar 570) dans les cellules U-2 OS (DAPI).

Les références

Lectures complémentaires

Liens externes