TILLING (biologie moléculaire) - TILLING (molecular biology)

TILLING ( Targeting Induced Local Lesions in Genomes ) est une méthode de biologie moléculaire qui permet l' identification dirigée de mutations dans un gène spécifique . TILLING a été introduit en 2000, en utilisant la plante modèle Arabidopsis thaliana , et étendu à d'autres utilisations et méthodologies par un petit groupe de scientifiques dont Luca Comai . Le TILLING a depuis été utilisé comme méthode de génétique inverse dans d'autres organismes tels que le poisson zèbre , le maïs , le blé , le riz , le soja , la tomate et la laitue .

Aperçu

La méthode combine une technique standard et efficace de mutagenèse utilisant un agent mutagène chimique tel que le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) avec une technique de criblage d'ADN sensible qui identifie les mutations d'une seule base (également appelées mutations ponctuelles) dans un gène cible. La méthode TILLING repose sur la formation d' hétéroduplex d' ADN qui se forment lorsque plusieurs allèles sont amplifiés par PCR puis chauffés et lentement refroidis. Une « bulle » se forme au niveau du mésappariement des deux brins d'ADN, qui est ensuite clivée par une nucléase simple brin . Les produits sont ensuite séparés par taille sur plusieurs plateformes différentes (voir ci-dessous).

Les mésappariements peuvent être dus à une mutation induite, à une hétérozygotie au sein d'un individu ou à une variation naturelle entre les individus.

EcoTILLING est une méthode qui utilise des techniques de TILLING pour rechercher des mutations naturelles chez les individus, généralement pour l'analyse génétique des populations. DEcoTILLING est une modification de TILLING et EcoTILLING qui utilise une méthode peu coûteuse pour identifier les fragments. Depuis l'avènement des technologies de séquençage NGS , le TILLING par séquençage a été développé sur la base du séquençage Illumina de gènes cibles amplifiés à partir de matrices multidimensionnelles regroupées pour identifier d'éventuelles modifications d'un seul nucléotide.

Enzymes de clivage simple brin

Il existe plusieurs sources de nucléases simple brin. La première enzyme largement utilisée était la nucléase du haricot mungo , mais il a été démontré que cette nucléase a une activité non spécifique élevée et ne fonctionne qu'à un pH faible, ce qui peut dégrader les produits de PCR et les amorces marquées par colorant. La source d'origine de la nucléase simple brin provenait de CEL1, ou CJE (extrait de jus de céleri), mais d'autres produits sont entrés sur le marché, notamment les enzymes SNiPerase de Frontier Genomics, qui ont été optimisées pour une utilisation sur des plateformes utilisant des produits PCR marqués et non marqués (voir section suivante). Transgenomic a isolé la protéine nucléase simple brin et la vend sous forme recombinante. L'avantage de la forme recombinante est que contrairement aux mélanges d'enzymes, elle ne contient pas d'activité nucléase non spécifique, qui peut dégrader les colorants sur les amorces PCR. L'inconvénient est un coût sensiblement plus élevé.

Séparation des produits clivés

Le premier article décrivant TILLING a utilisé la HPLC pour identifier les mutations (McCallum et al., 2000a). La méthode a été rendue plus performante en utilisant l' enzyme de restriction Cel-I combinée au système à base de gel LICOR pour identifier les mutations (Colbert et al., 2001). Les avantages de l'utilisation de ce système sont que les sites de mutation peuvent être facilement confirmés et différenciés du bruit. En effet, des colorants de couleurs différentes peuvent être utilisés pour les amorces directe et inverse. Une fois que les produits de clivage ont été exécutés sur un gel, il peut être visualisé dans des canaux séparés, et tout comme un RFLP, les tailles de fragments dans une voie dans chaque canal doivent s'ajouter à la taille du produit sur toute la longueur. Les avantages du système LICOR sont la séparation de gros fragments (~ 2 Ko), un débit d'échantillons élevé (96 échantillons chargés sur des peignes en papier) et un logiciel gratuit pour identifier les mutations (GelBuddy). Les inconvénients du système LICOR sont de devoir verser des gels en plaques et de longs temps d'exécution (~ 4 heures). Les méthodes TILLING et EcoTILLING sont maintenant utilisées sur les systèmes capillaires de Advanced Analytical Technologies, ABI et Beckman.

Plusieurs systèmes peuvent être utilisés pour séparer les produits PCR qui ne sont pas étiquetés avec des colorants. De simples systèmes d'électrophorèse sur agarose sépareront les produits de clivage à peu de frais et avec un équipement de laboratoire standard. Cela a été utilisé pour découvrir les SNP dans le saumon kéta et a été appelé DEcoTILLING. L'inconvénient de ce système est une résolution réduite par rapport aux systèmes de polyacrylamide. Elchrom Scientific vend des gels Spreadex qui sont préfabriqués, peuvent être à haut débit et sont plus sensibles que les gels de polyacrylamide standard. Advanced Analytical Technologies Inc vend le système fluorescent AdvanCE FS96 dsDNA qui est un système d'électrophorèse capillaire à 96 qui présente plusieurs avantages par rapport aux méthodes traditionnelles ; y compris la capacité de séparer de gros fragments (jusqu'à 40 kb), aucune étape de dessalage ou de précipitation requise, des temps d'exécution courts (~ 30 minutes), une sensibilité à 5 pg/ul et aucun besoin d'amorces marquées par fluorescence.

Centres de TRAVAIL

Il existe plusieurs centres de TILLING dans le monde qui se concentrent sur les espèces d'importance agricole :

  • Riz – UC Davis (États-Unis)
  • Maïs – Purdue University (USA)
  • Brassica napus – Université de la Colombie-Britannique (CA)
  • Brassica rapa – Centre John Innes (Royaume-Uni)
  • Arabidopsis – Fred Hutchinson Recherche sur le cancer
  • Soja – Southern Illinois University (États-Unis)
  • Lotus et Medicago – John Innes Center (Royaume-Uni)
  • Blé – UC Davis (États-Unis)
  • Pois, Tomate - INRA (France)
  • Tomate - RTGR, Université d'Hyderabad (Inde)

Les références

Littérature scientifique

Liens externes