Chromatographie ionique - Ion chromatography

Un système de chromatographie ionique moderne

La chromatographie ionique (ou chromatographie échangeuse d' ions ) sépare les ions et les molécules polaires en fonction de leur affinité pour l' échangeur d' ions . Il fonctionne sur presque tous les types de molécules chargées, y compris les grosses protéines , les petits nucléotides et les acides aminés . Cependant, la chromatographie ionique doit être effectuée dans des conditions éloignées d'une unité du point isoélectrique d'une protéine.

Les deux types de chromatographie ionique sont l'échange d'anions et l'échange de cations. La chromatographie échangeuse de cations est utilisée lorsque la molécule d'intérêt est chargée positivement. La molécule est chargée positivement car le pH pour la chromatographie est inférieur au pI (a/k/a pH(I)). Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est chargée négativement et les molécules chargées positivement sont chargées pour y être attirées. La chromatographie d'échange d'anions se produit lorsque la phase stationnaire est chargée positivement et que les molécules chargées négativement (ce qui signifie que le pH pour la chromatographie est supérieur au pI) sont chargées d'y être attirées. Il est souvent utilisé dans la purification des protéines, l'analyse de l'eau et le contrôle qualité. Les molécules hydrosolubles et chargées telles que les protéines, les acides aminés et les peptides se lient à des fragments qui sont chargés de manière opposée en formant des liaisons ioniques avec la phase stationnaire insoluble. La phase stationnaire équilibrée est constituée d'un groupe fonctionnel ionisable où les molécules ciblées d'un mélange à séparer et à quantifier peuvent se lier en traversant la colonne - une phase stationnaire cationique est utilisée pour séparer les anions et une phase stationnaire anionique est utilisée pour séparer les cations. La chromatographie d'échange de cations est utilisée lorsque les molécules souhaitées à séparer sont des cations et la chromatographie d'échange d'anions est utilisée pour séparer les anions. Les molécules liées peuvent ensuite être éluées et collectées à l'aide d'un éluant qui contient des anions et des cations en faisant passer une concentration plus élevée d'ions à travers la colonne ou en changeant le pH de la colonne.

L'un des principaux avantages de l'utilisation de la chromatographie ionique est qu'une seule interaction est impliquée lors de la séparation par opposition aux autres techniques de séparation ; par conséquent, la chromatographie ionique peut avoir une tolérance de matrice plus élevée. Un autre avantage de l'échange d'ions est la prévisibilité des schémas d'élution (basés sur la présence du groupe ionisable). Par exemple, lorsque la chromatographie d'échange de cations est utilisée, les cations seront élués en dernier. Pendant ce temps, les molécules chargées négativement seront éluées en premier. Cependant, il existe également des inconvénients lors de la réalisation de la chromatographie par échange d'ions, tels que l'évolution constante de la technique qui conduit à l'incohérence d'une colonne à l'autre. Une limitation majeure de cette technique de purification est qu'elle est limitée au groupe ionisable.

Histoire

Chromatographie échangeuse d'ions

La chromatographie ionique a progressé grâce à l'accumulation de connaissances au cours de nombreuses années. À partir de 1947, Spedding et Powell ont utilisé la chromatographie par échange d'ions par déplacement pour la séparation des terres rares. De plus, ils ont montré la séparation par échange d'ions des isotopes 14N et 15N dans l'ammoniac. Au début des années 1950, Kraus et Nelson ont démontré l'utilisation de nombreuses méthodes d'analyse des ions métalliques dépendant de leur séparation de leurs complexes chlorure, fluorure, nitrate ou sulfate par chromatographie anionique. La détection automatique en ligne a été progressivement introduite de 1960 à 1980 ainsi que de nouvelles méthodes chromatographiques pour la séparation des ions métalliques. Une méthode révolutionnaire de Small, Stevens et Bauman chez Dow Chemical Co. a dévoilé la création de la chromatographie ionique moderne. Les anions et les cations pouvaient désormais être séparés efficacement par un système de détection de conductivité supprimée. En 1979, une méthode de chromatographie anionique avec détection de conductivité non supprimée a été introduite par Gjerde et al. Après cela en 1980, était une méthode similaire pour la chromatographie cationique.

En conséquence, une période de concurrence extrême a commencé sur le marché des circuits intégrés, avec des partisans de la détection de conductivité supprimée et non supprimée. Cette compétition a conduit à une croissance rapide de nouvelles formes et à l'évolution rapide des circuits intégrés. Un défi qui doit être surmonté dans le développement futur des circuits intégrés est la préparation de colonnes monolithiques échangeuses d'ions hautement efficaces et surmonter ce défi serait d'une grande importance pour le développement des circuits intégrés.

L'essor de la chromatographie par échange d'ions a principalement commencé entre 1935 et 1950 pendant la Seconde Guerre mondiale et c'est grâce au « projet Manhattan » que les applications et les circuits intégrés ont été considérablement étendus. La chromatographie ionique a été introduite à l'origine par deux chercheurs anglais, l'agriculteur Sir Thompson et le chimiste JT Way. Les travaux de Thompson et Way impliquaient l'action de sels d'engrais solubles dans l'eau, de sulfate d'ammonium et de chlorure de potassium. Ces sels ne pouvaient pas être facilement extraits du sol à cause de la pluie. Ils ont utilisé des méthodes ioniques pour traiter les argiles avec les sels, ce qui a entraîné l'extraction de l'ammoniac en plus de la libération de calcium. C'est dans les années cinquante et soixante que des modèles théoriques ont été développés pour l'IC pour une meilleure compréhension et ce n'est que dans les années soixante-dix que les détecteurs continus ont été utilisés, ouvrant la voie au développement de la chromatographie basse pression à la chromatographie haute performance. Ce n'est qu'en 1975 que « chromatographie ionique » a été établie comme nom en référence aux techniques, et a ensuite été utilisée comme nom à des fins de marketing. Aujourd'hui, la CI est importante pour étudier les systèmes aqueux, tels que l'eau potable. C'est une méthode populaire pour analyser des éléments ou des complexes anioniques qui aident à résoudre des problèmes environnementaux pertinents. De même, il a également de grandes utilisations dans l' industrie des semi - conducteurs .

En raison des nombreuses colonnes de séparation, systèmes d' élution et détecteurs disponibles, la chromatographie est devenue la principale méthode d'analyse ionique.

Lorsque cette technique a été initialement développée, elle était principalement utilisée pour le traitement de l'eau. Depuis 1935, la chromatographie échangeuse d'ions s'est rapidement manifestée dans l'une des techniques les plus exploitées, ses principes étant souvent appliqués à la majorité des domaines de la chimie, y compris la distillation, l'adsorption et la filtration.

Principe

Chromatogramme ionique affichant la séparation des anions

La chromatographie par échange d'ions sépare les molécules en fonction de leurs groupes chargés respectifs. La chromatographie par échange d'ions retient les molécules d' analyte sur la colonne en fonction des interactions coulombiques (ioniques). La matrice de chromatographie échangeuse d'ions est constituée d'ions chargés positivement et négativement. Essentiellement, les molécules subissent des interactions électrostatiques avec des charges opposées sur la matrice de phase stationnaire. La phase stationnaire est constituée d'une matrice immobile qui contient des groupes fonctionnels ou des ligands ionisables chargés. La surface de la phase stationnaire affiche des groupes fonctionnels ioniques (RX) qui interagissent avec les ions analytes de charge opposée. Pour atteindre l'électroneutralité, ces charges inertes se couplent à des contre-ions échangeables dans la solution. Les molécules ionisables à purifier entrent en compétition avec ces contre-ions échangeables pour se lier aux charges immobilisées sur la phase stationnaire. Ces molécules ionisables sont retenues ou éluées en fonction de leur charge. Initialement, les molécules qui ne se lient pas ou se lient faiblement à la phase stationnaire sont les premières à être emportées. Des conditions modifiées sont nécessaires pour l'élution des molécules qui se lient à la phase stationnaire. La concentration des contre-ions échangeables, qui entrent en compétition avec les molécules pour la liaison, peut être augmentée ou le pH peut être modifié. Un changement de pH affecte la charge sur les molécules particulières et, par conséquent, modifie la liaison. Les molécules commencent alors à s'éluer en fonction des changements de leurs charges résultant des ajustements. D'autres ajustements de ce type peuvent être utilisés pour libérer la protéine d'intérêt. De plus, la concentration des contre-ions peut être progressivement modifiée pour séparer les molécules ionisées. Ce type d'élution est appelé élution à gradient. D'autre part, l'élution par étapes peut être utilisée dans laquelle la concentration des contre-ions varie en une seule étape. Ce type de chromatographie est subdivisé en chromatographie échangeuse de cations et chromatographie échangeuse d'anions . Les molécules chargées positivement se lient aux résines échangeuses de cations tandis que les molécules chargées négativement se lient aux résines échangeuses d'anions. Le composé ionique constitué de l'espèce cationique M+ et de l'espèce anionique B- peut être retenu par la phase stationnaire.

La chromatographie d'échange de cations retient les cations chargés positivement car la phase stationnaire affiche un groupe fonctionnel chargé négativement :

${\displaystyle {\text{RX}}^{-}{\text{C}}^{+}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}} ^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{-}{\text{M}}^{+}\,+\,{\text{C}}^{+}\,+\ ,{\text{B}}^{-}}$

La chromatographie d'échange d'anions retient les anions en utilisant un groupe fonctionnel chargé positivement :

${\displaystyle {\text{RX}}^{+}{\text{A}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,{\text{B}} ^{-}\rightleftarrows \,{\text{RX}}^{+}{\text{B}}^{-}\,+\,{\text{M}}^{+}\,+\ ,{\text{A}}^{-}}$

Notez que la force ionique de C+ ou A- dans la phase mobile peut être ajustée pour déplacer la position d'équilibre, donc le temps de rétention.

Le chromatogramme ionique montre un chromatogramme typique obtenu avec une colonne échangeuse d'anions.

Procédure

Avant que la chromatographie d'échange d'ions puisse être initiée, elle doit être équilibrée. La phase stationnaire doit être équilibrée par rapport à certaines exigences qui dépendent de l'expérience avec laquelle vous travaillez. Une fois équilibrés, les ions chargés dans la phase stationnaire seront attachés à ses ions échangeables chargés opposés. Ions échangeables tels que Cl- ou Na+. Ensuite, un tampon doit être choisi dans lequel la protéine souhaitée peut se lier. Après équilibrage, la colonne doit être lavée. La phase de lavage aidera à éluer toutes les impuretés qui ne se lient pas à la matrice tandis que la protéine d'intérêt reste liée. Ce tampon d'échantillon doit avoir le même pH que le tampon utilisé pour l'équilibrage pour aider à lier les protéines souhaitées. Les protéines non chargées seront éluées hors de la colonne à une vitesse similaire à celle du tampon circulant dans la colonne. Une fois que l'échantillon a été chargé sur la colonne et que la colonne a été lavée avec le tampon pour éluer toutes les protéines non souhaitées, l'élution est effectuée pour éluer les protéines souhaitées qui sont liées à la matrice. Les protéines liées sont éluées en utilisant un gradient de concentration en sel augmentant linéairement. Avec l'augmentation de la force ionique du tampon, les ions sels entreront en compétition avec les protéines souhaitées afin de se lier aux groupes chargés à la surface du milieu. Cela entraînera l'élution des protéines souhaitées hors de la colonne. Les protéines qui ont une faible charge nette seront éluées en premier lorsque la concentration en sel augmente, entraînant une augmentation de la force ionique. Les protéines avec une charge nette élevée auront besoin d'une force ionique plus élevée pour être éluées hors de la colonne. Il est possible d'effectuer une chromatographie échangeuse d'ions en masse, sur des couches minces de support telles que des plaques de verre ou de plastique recouvertes d'une couche de la phase stationnaire souhaitée, ou dans des colonnes de chromatographie. La chromatographie sur couche mince ou la chromatographie sur colonne partagent des similitudes en ce sens qu'elles agissent toutes deux selon les mêmes principes directeurs; il y a un échange constant et fréquent de molécules au fur et à mesure que la phase mobile se déplace le long de la phase stationnaire. Il n'est pas impératif d'ajouter l'échantillon en volumes infimes car les conditions prédéterminées pour la colonne d'échange ont été choisies pour qu'il y ait une forte interaction entre les phases mobile et stationnaire. De plus, le mécanisme du processus d'élution entraînera une compartimentation des différentes molécules en fonction de leurs caractéristiques chimiques respectives. Ce phénomène est dû à une augmentation des concentrations de sel au sommet ou près du sommet de la colonne, déplaçant ainsi les molécules à cette position, tandis que les molécules liées plus bas sont libérées à un moment ultérieur lorsque la concentration de sel la plus élevée atteint cette zone. Ces principes sont les raisons pour lesquelles la chromatographie par échange d'ions est un excellent candidat pour les premières étapes de chromatographie dans une procédure de purification complexe, car elle peut rapidement produire de petits volumes de molécules cibles, quel que soit le volume de départ plus important.

La chambre (à gauche) contient une concentration élevée en sel. La chambre agitée (à droite) contient une faible concentration en sel. Une agitation progressive provoque la formation d'un gradient de sel lorsque le sel passe de concentrations élevées à faibles.

Des dispositifs relativement simples sont souvent utilisés pour appliquer des contre - ions de gradient croissant à une colonne de chromatographie. Les contre-ions tels que le cuivre (II) sont choisis le plus souvent pour séparer efficacement les peptides et les acides aminés par la formation de complexes.

Un simple appareil peut être utilisé pour créer un gradient de sel. Le tampon d'élution est constamment aspiré de la chambre dans la chambre de mélange, modifiant ainsi sa concentration en tampon. Généralement, le tampon placé dans la chambre est habituellement de concentration initiale élevée, alors que le tampon placé dans la chambre agitée est habituellement de faible concentration. Au fur et à mesure que le tampon à haute concentration de la chambre de gauche est mélangé et aspiré dans la colonne, la concentration de tampon de la colonne agitée augmente progressivement. La modification des formes de la chambre d'agitation, ainsi que du tampon limite, permet la production de gradients concaves, linéaires ou convexes de contre-ions.

Une multitude de médiums différents sont utilisés pour la phase stationnaire. Parmi les groupes chargés immobilisés les plus couramment utilisés figurent le triméthylaminoéthyle (TAM), le triéthylaminoéthyle (TEAE), le diéthyl-2-hydroxypropylaminoéthyle (QAE), l'aminoéthyle (AE), le diéthylaminoéthyle (DEAE), le sulfo (S), le sulfométhyl (SM), le sulfopropyl ( SP), carboxy (C) et carboxyméthyle (CM).

Le remplissage réussi de la colonne est un aspect important de la chromatographie ionique. La stabilité et l'efficacité d'une colonne finale dépendent des méthodes de remplissage, du solvant utilisé et des facteurs qui affectent les propriétés mécaniques de la colonne. Contrairement aux premières méthodes de compactage à sec inefficaces, le compactage à lisier humide, dans lequel les particules en suspension dans un solvant approprié sont envoyées dans une colonne sous pression, montre une amélioration significative. Trois approches différentes peuvent être utilisées pour effectuer le compactage de la boue humide : la méthode de densité équilibrée (la densité du solvant est à peu près celle des particules de silice poreuse), la méthode à haute viscosité (un solvant de haute viscosité est utilisé) et la méthode de la boue à faible viscosité (effectuée avec des solvants à faible viscosité).

Le polystyrène est utilisé comme moyen d'échange d'ions. Il est fabriqué à partir de la polymérisation du styrène avec l'utilisation de divinylbenzène et de peroxyde de benzoyle. De tels échangeurs forment des interactions hydrophobes avec des protéines qui peuvent être irréversibles. En raison de cette propriété, les échangeurs d'ions en polystyrène ne sont pas adaptés à la séparation des protéines. Ils sont utilisés d'autre part pour la séparation de petites molécules dans la séparation des acides aminés et l'élimination du sel de l'eau. Les échangeurs d'ions en polystyrène à pores larges peuvent être utilisés pour la séparation des protéines mais doivent être recouverts d'une substance hydrophile.

Le milieu à base de cellulose peut être utilisé pour la séparation de grosses molécules car ils contiennent de gros pores. La liaison aux protéines dans ce milieu est élevée et a un faible caractère hydrophobe. DEAE est une matrice échangeuse d'anions qui est produite à partir d'un groupe latéral positif de diéthylaminoéthyle lié à la cellulose ou au Sephadex.

Le milieu à base de gel d'agarose contient également de grands pores, mais leur capacité de substitution est inférieure à celle des dextranes. La capacité du milieu à gonfler en liquide est fonction de la réticulation de ces substances, du pH et des concentrations ioniques des tampons utilisés.

L'incorporation d'une température et d'une pression élevées permet une augmentation significative de l'efficacité de la chromatographie ionique, ainsi qu'une diminution du temps. La température a une influence sur la sélectivité en raison de ses effets sur les propriétés de rétention. Le facteur de rétention ( k = ( t _R ^g − t _M ^g )/( t _M ^g − t _ext )) augmente avec la température pour les petits ions, et la tendance inverse est observée pour les plus gros ions.

Malgré la sélectivité ionique dans différents milieux, des recherches supplémentaires sont en cours pour effectuer une chromatographie d'échange d'ions dans la plage de 40 à 175 °C.

Un solvant approprié peut être choisi en fonction des observations du comportement des particules de la colonne dans un solvant. En utilisant un microscope optique, on peut facilement distinguer un état dispersé souhaitable de suspension des particules agrégées.

Échangeurs d'ions faibles et forts

Un échangeur d'ions "fort" ne perdra pas la charge de sa matrice une fois la colonne équilibrée et donc une large gamme de tampons de pH peut être utilisée. Les échangeurs d'ions "faibles" ont une plage de valeurs de pH dans laquelle ils maintiendront leur charge. Si le pH du tampon utilisé pour une colonne à faible échange d'ions sort de la plage de capacité de la matrice, la colonne perdra sa distribution de charge et la molécule d'intérêt peut être perdue. Malgré la plage de pH plus petite des échangeurs d'ions faibles, ils sont souvent utilisés par rapport aux échangeurs d'ions forts en raison de leur plus grande spécificité. Dans certaines expériences, les temps de rétention des échangeurs d'ions faibles sont juste assez longs pour obtenir les données souhaitées avec une spécificité élevée.

Les résines (souvent appelées « billes ») des colonnes échangeuses d'ions peuvent inclure des groupes fonctionnels tels que des acides faibles/forts et des bases faibles/fortes. Il existe également des colonnes spéciales qui ont des résines avec des groupes fonctionnels amphotères qui peuvent échanger à la fois des cations et des anions. Quelques exemples de groupes fonctionnels de résines échangeuses d'ions fortes sont le cation ammonium quaternaire (Q), qui est un échangeur d'anions, et l'acide sulfonique (S, -SO ₂ OH), qui est un échangeur de cations. Ces types d'échangeurs peuvent maintenir leur densité de charge sur une plage de pH de 0 à 14. Des exemples de groupes fonctionnels de résines échangeuses d'ions faibles comprennent le diéthylaminoéthyle (DEAE, -C ₂ H ₄ N(CH ₂ H ₅ ) ₂ ), qui est un échangeur d'anions, et le carboxyméthyle (CM, -CH ₂ -COOH), qui est un échangeur de cations. Ces deux types d'échangeurs peuvent maintenir la densité de charge de leurs colonnes sur une plage de pH de 5 à 9.

En chromatographie ionique, l'interaction des ions solutés et de la phase stationnaire en fonction de leurs charges détermine quels ions se lieront et à quel degré. Lorsque la phase stationnaire comporte des groupes positifs qui attirent les anions, on parle d'échangeur d'anions ; lorsqu'il y a des groupes négatifs sur la phase stationnaire, les cations sont attirés et c'est un échangeur de cations. L'attraction entre les ions et la phase stationnaire dépend également de la résine, particules organiques utilisées comme échangeurs d'ions.

Chaque résine présente une sélectivité relative qui varie en fonction des ions solutés présents qui entreront en compétition pour se lier au groupe résine sur la phase stationnaire. Le coefficient de sélectivité, l'équivalent de la constante d'équilibre, est déterminé via un rapport des concentrations entre la résine et chaque ion, cependant, la tendance générale est que les échangeurs d'ions préfèrent se lier à l'ion avec une charge plus élevée, un rayon hydraté plus petit, et une polarisabilité plus élevée, ou la capacité du nuage d'électrons d'un ion à être perturbé par d'autres charges. Malgré cette sélectivité, des quantités excessives d'un ion avec une sélectivité inférieure introduites dans la colonne amèneraient l'ion le plus petit à se lier davantage à la phase stationnaire car le coefficient de sélectivité permet des fluctuations dans la réaction de liaison qui a lieu pendant la chromatographie d'échange d'ions.

Le tableau suivant montre les échangeurs d'ions couramment utilisés

Technique typique

Un échantillon est introduit, soit manuellement, soit avec un passeur d' échantillons , dans une boucle d'échantillon de volume connu. Une solution aqueuse tamponnée connue sous le nom de phase mobile transporte l'échantillon de la boucle sur une colonne qui contient une certaine forme de matériau de phase stationnaire. Il s'agit typiquement d'une matrice de résine ou de gel constituée de billes d' agarose ou de cellulose avec des groupes fonctionnels chargés liés par covalence . L'équilibrage de la phase stationnaire est nécessaire afin d'obtenir la charge souhaitée de la colonne. Si la colonne n'est pas correctement équilibrée, la molécule souhaitée peut ne pas se lier fortement à la colonne. Les analytes cibles (anions ou cations) sont retenus sur la phase stationnaire mais peuvent être élués en augmentant la concentration d'une espèce chargée de manière similaire qui déplace les ions analytes de la phase stationnaire. Par exemple, en chromatographie échangeuse de cations, l'analyte chargé positivement peut être déplacé en ajoutant des ions sodium chargés positivement. Les analytes d'intérêt doivent ensuite être détectés par certains moyens, typiquement par conductivité ou absorbance de la lumière UV/visible.

Le contrôle d'un système IC nécessite généralement un système de données chromatographiques (CDS). En plus des systèmes IC, certains de ces CDS peuvent également contrôler la chromatographie en phase gazeuse (GC) et la HPLC.

Chromatographie d'échange membranaire

Un type de chromatographie d'échange d'ions, l'échange sur membrane est une méthode de purification relativement nouvelle conçue pour surmonter les limites de l'utilisation de colonnes remplies de billes. Les appareils de chromatographie à membrane sont bon marché à produire en série et jetables, contrairement à d'autres appareils de chromatographie qui nécessitent un entretien et du temps pour être revalidés. Il existe trois types d'absorbeurs à membrane qui sont généralement utilisés lors de la séparation de substances. Les trois types sont la feuille plate, la fibre creuse et le flux radial. L'absorbeur le plus courant et le mieux adapté à la chromatographie sur membrane est constitué de plusieurs feuilles plates car il a un volume plus absorbant. Il peut être utilisé pour surmonter les limitations de transfert de masse et la chute de pression, ce qui le rend particulièrement avantageux pour isoler et purifier les virus, l'ADN plasmidique et d'autres macromolécules de grande taille. La colonne est remplie de membranes microporeuses avec des pores internes qui contiennent des fragments d'adsorption pouvant se lier à la protéine cible. Les membranes adsorbantes sont disponibles dans une variété de géométries et de chimies, ce qui leur permet d'être utilisées pour la purification ainsi que pour le fractionnement, la concentration et la clarification avec une efficacité 10 fois supérieure à celle de l'utilisation de billes. Les membranes peuvent être préparées par isolement de la membrane elle-même, où les membranes sont coupées en carrés et immobilisées. Une méthode plus récente impliquait l'utilisation de cellules vivantes qui sont attachées à une membrane de support et sont utilisées pour l'identification et la clarification des molécules de signalisation.

Séparation des protéines

Colonne échangeuse d'ions à l'échelle préparatoire utilisée pour la purification des protéines .

La chromatographie par échange d'ions peut être utilisée pour séparer les protéines car elles contiennent des groupes fonctionnels chargés. Les ions d'intérêt (dans ce cas des protéines chargées) sont échangés contre d'autres ions (généralement H ⁺ ) sur un support solide chargé. Les solutés sont le plus souvent en phase liquide, qui a tendance à être de l'eau. Prenons par exemple les protéines dans l'eau, qui serait une phase liquide passée dans une colonne. La colonne est communément appelée phase solide car elle est remplie de particules synthétiques poreuses ayant une charge particulière. Ces particules poreuses sont également appelées billes, peuvent être aminés (contenant des groupes amino) ou comporter des ions métalliques afin d'avoir une charge. La colonne peut être préparée à l'aide de polymères poreux, pour les macromolécules supérieures à 100 000 la taille optimale de la particule poreuse est d'environ 1 µm ² . En effet, une diffusion lente des solutés à l'intérieur des pores ne restreint pas la qualité de séparation. Les billes contenant des groupes chargés positivement, qui attirent les protéines chargées négativement, sont communément appelées résines échangeuses d'anions. Les acides aminés qui ont des chaînes latérales chargées négativement à pH 7 (pH de l'eau) sont le glutamate et l'aspartate. Les billes chargées négativement sont appelées résines échangeuses de cations, car les protéines chargées positivement seront attirées. Les acides aminés qui ont des chaînes latérales chargées positivement à pH 7 sont la lysine, l'histidine et l'arginine.

Le point isoélectrique est le pH auquel un composé - dans ce cas une protéine - n'a pas de charge nette. Le point isoélectrique ou PI d'une protéine peut être déterminé en utilisant le pKa des chaînes latérales, si l'amino (chaîne positive) est capable d'annuler la chaîne carboxyle (négative), la protéine serait à son PI. Utiliser des tampons à la place de l'eau pour les protéines qui n'ont pas de charge à pH 7, est une bonne idée car cela permet de manipuler le pH pour modifier les interactions ioniques entre les protéines et les billes. Les chaînes latérales faiblement acides ou basiques peuvent avoir une charge si le pH est respectivement suffisamment élevé ou bas. La séparation peut être réalisée sur la base du point isoélectrique naturel de la protéine. Alternativement, une étiquette peptidique peut être génétiquement ajoutée à la protéine pour donner à la protéine un point isoélectrique loin de la plupart des protéines naturelles (par exemple, 6 arginines pour se lier à une résine échangeuse de cations ou 6 glutamates pour se lier à une résine échangeuse d'anions telle que DEAE -Sépharose).

L'élution par augmentation de la force ionique de la phase mobile est plus subtile. Cela fonctionne parce que les ions de la phase mobile interagissent avec les ions immobilisés sur la phase stationnaire, "protégeant" ainsi la phase stationnaire de la protéine et laissant la protéine s'éluer.

L'élution des colonnes échangeuses d'ions peut être sensible aux changements d'une seule charge- chromatofocalisation . La chromatographie par échange d'ions est également utile dans l'isolement d'assemblages de protéines multimères spécifiques, permettant la purification de complexes spécifiques en fonction à la fois du nombre et de la position des marqueurs peptidiques chargés.

Effet Gibbs-Donnan

En chromatographie échangeuse d'ions, l'effet Gibbs-Donnan est observé lorsque le pH du tampon appliqué et de l'échangeur d'ions diffèrent, même jusqu'à une unité de pH. Par exemple, dans les colonnes échangeuses d'anions, les échangeurs d'ions abrogent les protons de sorte que le pH du tampon à proximité de la colonne diffère est plus élevé que le reste du solvant. En conséquence, un expérimentateur doit veiller à ce que la ou les protéines d'intérêt soient stables et correctement chargées dans le pH « réel ».

Cet effet est dû au fait que deux particules chargées de manière similaire, l'une provenant de la résine et l'autre de la solution, ne se répartissent pas correctement entre les deux côtés ; il y a une absorption sélective d'un ion par rapport à un autre. Par exemple, dans une résine polystyrène sulfonée, une résine échangeuse de cations, l'ion chlore d'un tampon acide chlorhydrique doit s'équilibrer dans la résine. Cependant, comme la concentration de l'acide sulfonique dans la résine est élevée, l'hydrogène de HCl n'a pas tendance à entrer dans la colonne. Ceci, combiné au besoin d'électroneutralité, conduit à une quantité minimale d'hydrogène et de chlore entrant dans la résine.

Les usages

Utilité clinique

Une utilisation de la chromatographie ionique peut être observée dans la chromatographie d'argentation . Habituellement, l'argent et les composés contenant des liaisons acétyléniques et éthyléniques ont des interactions très faibles. Ce phénomène a été largement testé sur des composés oléfiniques. Les complexes ioniques que les oléfines forment avec les ions argent sont faibles et fabriqués sur la base du chevauchement des orbitales pi, sigma et d et des électrons disponibles, par conséquent, ne provoquent aucun changement réel dans la double liaison. Ce comportement a été manipulé pour séparer les lipides, principalement les acides gras, des mélanges en fractions avec un nombre différent de doubles liaisons en utilisant des ions argent. Les résines ioniques ont été imprégnées d'ions d'argent, qui ont ensuite été exposés à divers acides (acide silicique) pour éluer des acides gras de caractéristiques différentes.

Des limites de détection aussi basses que 1 M peuvent être obtenues pour les ions de métaux alcalins. Il peut être utilisé pour la mesure de l' HbA1c , de la porphyrine et pour la purification de l'eau . Les résines échangeuses d'ions (IER) ont été largement utilisées, en particulier dans les médicaments en raison de leur grande capacité et du système simple du processus de séparation. L'une des utilisations synthétiques consiste à utiliser des résines échangeuses d'ions pour la dialyse rénale. Cette méthode est utilisée pour séparer les éléments sanguins en utilisant le rein artificiel à membrane de cellulose.

Une autre application clinique de la chromatographie ionique est la technique de chromatographie d'échange rapide d'anions utilisée pour séparer les isoenzymes de la créatine kinase (CK) du sérum et des tissus humains provenant du matériel d'autopsie (principalement des tissus riches en CK ont été utilisés, tels que le muscle cardiaque et le cerveau). Ces isoenzymes comprennent MM, MB et BB, qui remplissent toutes la même fonction en fonction de différentes séquences d'acides aminés. Les fonctions de ces isoenzymes sont de convertir la créatine, en utilisant l'ATP, en phosphocréatine expulsant l'ADP. Des mini-colonnes ont été remplies de DEAE-Sephadex A-50 et encore éluées avec du chlorure de sodium tris-tampon à diverses concentrations (chaque concentration a été choisie avantageusement pour manipuler l'élution). L'extrait de tissu humain a été inséré dans des colonnes pour la séparation. Toutes les fractions ont été analysées pour voir l'activité CK totale et il a été constaté que chaque source d'isoenzymes CK avait des isoenzymes caractéristiques trouvées à l'intérieur. Tout d'abord, CK-MM a été élué, puis CK-MB, suivi de CK-BB. Par conséquent, les isoenzymes trouvées dans chaque échantillon pourraient être utilisées pour identifier la source, car elles étaient spécifiques aux tissus.

En utilisant les informations des résultats, une corrélation a pu être établie sur le diagnostic des patients et le type d'isoenzymes CK trouvées dans l'activité la plus abondante. D'après cette découverte, environ 35 des 71 patients étudiés souffraient d'une crise cardiaque (infarctus du myocarde) contenaient également une quantité abondante d'isoenzymes CK-MM et CK-MB. Les résultats montrent en outre que de nombreux autres diagnostics, y compris l'insuffisance rénale, les maladies cérébrovasculaires et les maladies pulmonaires, n'avaient que l'isoenzyme CK-MM et aucune autre isoenzyme. Les résultats de cette étude indiquent des corrélations entre diverses maladies et les isoenzymes CK trouvées, ce qui confirme les résultats des tests précédents utilisant diverses techniques. Les études sur la CK-MB trouvée chez les victimes de crise cardiaque se sont étendues depuis cette étude et l'application de la chromatographie ionique.

Applications industrielles

Depuis 1975, la chromatographie ionique est largement utilisée dans de nombreuses branches de l'industrie. Les principaux avantages bénéfiques sont la fiabilité, une très bonne exactitude et précision, une sélectivité élevée, une vitesse élevée, une efficacité de séparation élevée et un faible coût des consommables. Les développements les plus significatifs liés à la chromatographie ionique sont les nouvelles méthodes de préparation d'échantillons ; améliorer la vitesse et la sélectivité de la séparation des analytes ; abaissement des limites de détection et des limites de quantification ; l'extension du champ d'applications ; développement de nouvelles méthodes standard; miniaturisation et extension du champ d'analyse d'un nouveau groupe de substances. Permet des tests quantitatifs de l'électrolyte et des additifs exclusifs des bains de galvanoplastie . Il s'agit d'une avancée des tests qualitatifs des cellules de coque ou des tests UV moins précis. Les ions, les catalyseurs, les azurants et les accélérateurs peuvent être mesurés. La chromatographie par échange d'ions est progressivement devenue une technique universelle largement connue pour la détection d'espèces à la fois anioniques et cationiques. Des applications à ces fins ont été développées, ou sont en cours de développement, pour une variété de domaines d'intérêt, et en particulier, l'industrie pharmaceutique. L'utilisation de la chromatographie d'échange d'ions dans les produits pharmaceutiques a augmenté ces dernières années, et en 2006, un chapitre sur la chromatographie d'échange d'ions a été officiellement ajouté à la Pharmacopia des États-Unis - National Formulary (USP-NF). De plus, en 2009 par la publication de l'USP-NF, la Pharmacopia des États-Unis a rendu disponible plusieurs analyses de chromatographie ionique en utilisant deux techniques : la détection par conductivité, ainsi que la détection ampérométrique pulsée . La majorité de ces applications sont principalement utilisées pour mesurer et analyser les limites résiduelles dans les produits pharmaceutiques, y compris la détection des limites d'oxalate, d'iodure, de sulfate, de sulfamate, de phosphate, ainsi que divers électrolytes, notamment le potassium et le sodium. Au total, l'édition 2009 de l'USP-NF a officiellement publié vingt-huit méthodes de détection pour l'analyse de composés actifs, ou de composants de composés actifs, utilisant soit la détection par conductivité, soit la détection ampérométrique à impulsions.

Développement de médicaments

Un système de chromatographie ionique utilisé pour détecter et mesurer des cations tels que le sodium, l'ammonium et le potassium dans les formulations expectorantes contre la toux.

Il y a eu un intérêt croissant pour l'application de l'IC dans l'analyse des médicaments pharmaceutiques. IC est utilisé dans différents aspects du développement de produits et des tests de contrôle qualité. Par exemple, IC est utilisé pour améliorer les propriétés de stabilité et de solubilité des molécules de médicaments actifs pharmaceutiques ainsi que pour détecter les systèmes qui ont une tolérance plus élevée pour les solvants organiques. IC a été utilisé pour la détermination des analytes dans le cadre d'un test de dissolution. Par exemple, des tests de dissolution du calcium ont montré que d'autres ions présents dans le milieu peuvent être bien résolus entre eux et également à partir de l'ion calcium. Par conséquent, IC a été utilisé dans des médicaments sous forme de comprimés et de capsules afin de déterminer la quantité de médicament dissous avec le temps. IC est également largement utilisé pour la détection et la quantification d'excipients ou d'ingrédients inactifs utilisés dans les formulations pharmaceutiques. La détection du sucre et de l'alcool de sucre dans de telles formulations par IC a été effectuée en raison de la résolution de ces groupes polaires dans la colonne d'ions. Méthodologie IC également établie dans l'analyse des impuretés dans les substances médicamenteuses et les produits. Les impuretés ou tout composant qui ne fait pas partie de l'entité chimique du médicament sont évalués et ils donnent des indications sur les quantités maximales et minimales de médicament qui doivent être administrées à un patient par jour.

Voir également

• Chromatographie échangeuse d'anions
• Chromatofocalisation
• Chromatographie en phase liquide à haute performance
• Point isoelectrique

Les références

Bibliographie

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• Gjerde, Douglas T. ; Fritz, James S. (2000). Chromatographie ionique . Weinheim : Wiley-VCH. ISBN 978-3-527-29914-0.
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• Ghosh, Raja (2002). « Séparation des protéines à l'aide de la chromatographie sur membrane : opportunités et défis ». Journal de chromatographie A . 952 (1) : 13-27. doi : 10.1016/s0021-9673(02)00057-2 . PMID  12064524 .

Liens externes

• Médias liés à la chromatographie ionique sur Wikimedia Commons

• Instruments LC chez Curlie