Réaction en chaîne de la ligase - Ligase chain reaction
La réaction en chaîne de la ligase ( LCR ) est une méthode d' amplification de l' ADN . La réaction en chaîne par ligase (LCR) est un processus d'amplification qui diffère de la PCR en ce qu'elle implique une ligase thermostable pour joindre deux sondes ou d'autres molécules ensemble qui peuvent ensuite être amplifiées par un cycle de réaction en chaîne par polymérase (PCR) standard (Barany, 1991). Chaque cycle entraîne un doublement de la molécule d'acide nucléique cible. Un avantage clé de la LCR est une plus grande spécificité par rapport à la PCR. Ainsi, la LCR nécessite deux enzymes complètement différentes pour fonctionner correctement : la ligase , pour joindre les molécules sondes ensemble, et une polymérase thermostable (par exemple, la polymérase Taq ) pour amplifier ces molécules impliquées dans une ligature réussie. Les sondes impliquées dans la ligature sont conçues de telle sorte que l'extrémité 5' d'une sonde soit directement adjacente à l'extrémité 3' de l'autre sonde, fournissant ainsi les substrats des groupes 3'-OH et 5'-PO4 requis pour la ligase.
La LCR a été développée à l'origine pour détecter les mutations ponctuelles ; un seul mésappariement de base à la jonction des deux molécules sondes est tout ce qui est nécessaire pour empêcher la ligature. En effectuant la ligature juste au niveau de la Tm de la sonde oligonucléotidique, seuls des duplex amorce/matrice parfaitement appariés seront tolérés. La LCR peut également être utilisée pour amplifier des molécules matrices qui ont été ligaturées avec succès dans le but d'évaluer l'efficacité de la ligature et de produire une grande quantité de produit avec une spécificité encore plus grande que la PCR. Ainsi, la LCR n'est pas nécessairement une alternative, mais plutôt un complément à la PCR.
Conditions cibles
Il a été largement utilisé pour la détection de mutations sur une seule base , comme dans les maladies génétiques .
La LCR et la PCR peuvent être utilisées pour détecter la gonorrhée et la chlamydia , et peuvent être effectuées sur des échantillons d' urine de première capture , permettant une collecte facile et une grande quantité d'organismes. Les inhibiteurs endogènes limitent la sensibilité , mais si cet effet pouvait être éliminé, la LCR et la PCR auraient des avantages cliniques par rapport à toute autre méthode de diagnostic de la gonorrhée et de la chlamydia. Parmi ces méthodes, la LCR est en train de devenir la méthode la plus sensible avec une spécificité élevée pour la détection connue du polymorphisme mononucléotidique (SNP) (20). La LCR a d'abord été développée par Barany, qui a utilisé une ADN ligase thermostable pour faire la distinction entre l'ADN normal et mutant et pour amplifier le produit spécifique à l'allèle. Un mésappariement à l'extrémité 3' de l'amorce discriminante empêche l'ADN ligase de joindre les deux fragments entre eux. En utilisant les deux brins d'ADN génomique comme cibles pour l'hybridation d'oligonucléotides, les produits générés à partir de deux ensembles d'amorces oligonucléotidiques adjacentes, complémentaires de chaque brin cible dans un cycle de ligature, peuvent devenir les cibles pour le cycle suivant. La quantité des produits peut ainsi être augmentée de façon exponentielle par des cycles thermiques répétés.
Voir également
Les références
Lecture générale
- Walker, JM et Rapley, R. (2005). Manuel des biométhodes médicales. Totowa, New Jersey : Humana Press. ISBN 978-1-59259-870-0