Dosage MTT - MTT assay
Le test MTT est un test colorimétrique permettant d'évaluer l'activité métabolique des cellules. Les enzymes cellulaires oxydoréductase dépendantes de NAD(P)H peuvent, dans des conditions définies, refléter le nombre de cellules viables présentes. Ces enzymes sont capables de réduire le bromure de tétrazolium MTT 3-(4,5- di méthyl thiazol -2-yl)-2,5-di phényl tétrazolium en son formazan insoluble , qui a une couleur pourpre. D'autres colorants tétrazolium étroitement liés, notamment XTT, MTS et les WST, sont utilisés en conjonction avec l'accepteur d'électrons intermédiaire, le 1-méthoxy phénazine méthosulfate (PMS). Avec WST-1, qui est imperméable aux cellules, la réduction se produit à l'extérieur de la cellule via le transport d'électrons dans la membrane plasmique. Cependant, cette explication traditionnellement supposée est actuellement contestée car la preuve a également été trouvée de la réduction du MTT en formazan dans les structures cellulaires lipidiques sans implication apparente des oxydoréductases.
Les dosages de colorant tétrazolium peuvent également être utilisés pour mesurer la cytotoxicité (perte de cellules viables) ou l'activité cytostatique (passage de la prolifération à la quiescence) d'agents médicinaux potentiels et de substances toxiques. Les dosages MTT sont généralement effectués dans l'obscurité car le réactif MTT est sensible à la lumière.
Le MTT , un tétrazole jaune , est réduit en formazan violet dans les cellules vivantes. Une solution de solubilisation (généralement soit du diméthylsulfoxyde , une solution d'éthanol acidifié ou une solution du détergent dodécylsulfate de sodium dans de l'acide chlorhydrique dilué ) est ajoutée pour dissoudre le produit formazan violet insoluble dans une solution colorée. L' absorbance de cette solution colorée peut être quantifiée en mesurant à une certaine longueur d'onde (généralement entre 500 et 600 nm) par un spectrophotomètre . Le degré d'absorption de la lumière dépend du degré de concentration de formazan accumulé à l'intérieur de la cellule et à la surface de la cellule. Plus la concentration en formazan est élevée, plus la couleur pourpre est foncée et donc plus l'absorbance est élevée.
XTT (2,3-bis-(2-méthoxy-4-nitro-5-sulfophényl)-2H-tétrazolium-5-carboxanilide) a été proposé pour remplacer le MTT, offrant une sensibilité plus élevée et une plage dynamique plus élevée. Le colorant formazan formé est soluble dans l'eau, évitant une étape de solubilisation finale.
Les sels de tétrazolium hydrosolubles sont des alternatives plus récentes au MTT : ils ont été développés en introduisant des charges positives ou négatives et des groupes hydroxy dans le cycle phényle du sel de tétrazolium, ou mieux avec des groupes sulfonate ajoutés directement ou indirectement au cycle phényle.
Le MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium), en présence de méthosulfate de phénazine ( PMS ), produit un formazan produit ayant une absorbance maximale à 490 nm dans une solution saline tamponnée au phosphate. Le test MTS est souvent décrit comme un test MTT « en une étape », qui offre la commodité d'ajouter le réactif directement à la culture cellulaire sans les étapes intermittentes requises dans le test MTT. Cependant, cette commodité rend le test MTS sensible aux interférences colorimétriques car les étapes intermittentes du test MTT éliminent les traces de composés colorés, tandis que ceux-ci restent dans la plaque de microtitration dans le test MTS en une étape. Des précautions sont nécessaires pour garantir l'exactitude lors de l'utilisation de ce test et il existe de solides arguments pour confirmer les résultats MTS en utilisant des observations qualitatives au microscope. (Ceci, cependant, est prudent pour tous les dosages colorimétriques.)
Les WST (sels de tétrazolium solubles dans l'eau) sont une série d'autres colorants solubles dans l'eau pour les tests MTT, développés pour donner différents spectres d'absorption des formazans formés. Le WST-1 et en particulier le WST-8 (2-(2-méthoxy-4-nitrophényl)-3-(4-nitrophényl)-5-(2,4-disulfophényl)-2H-tétrazolium), sont avantageux par rapport au MTT dans qu'ils sont réduits à l'extérieur des cellules, combinés avec le médiateur électronique PMS, et donnent un formazan soluble dans l'eau. Enfin, les tests WST (1) peuvent être lus directement (contrairement au MTT qui nécessite une étape de solubilisation), (2) donnent un signal plus efficace que le MTT, et (3) diminuent la toxicité pour les cellules (contrairement au MTT perméable aux cellules, et son insoluble formazan qui s'accumule à l'intérieur des cellules).
Signification du test MTT
On suppose généralement que la réduction du colorant au tétrazolium dépend des enzymes oxydoréductase dépendantes du NAD(P)H en grande partie dans le compartiment cytosolique de la cellule. Par conséquent, la réduction du MTT et d'autres colorants au tétrazolium dépend de l'activité métabolique cellulaire due au flux de NAD(P)H. Les cellules à faible métabolisme telles que les thymocytes et les splénocytes réduisent très peu le MTT. En revanche, les cellules à division rapide présentent des taux élevés de réduction du MTT. Il est important de garder à l'esprit que les conditions de dosage peuvent altérer l'activité métabolique et donc la réduction du colorant tétrazolium sans affecter la viabilité cellulaire. De plus, le mécanisme de réduction des colorants tétrazolium, c'est -à- dire intracellulaire (MTT, MTS) vs extracellulaire (WST-1), déterminera également la quantité de produit. De plus, des preuves ont été apportées quant à la réduction spontanée du MTT dans les compartiments/structures cellulaires lipidiques, sans catalyse enzymatique impliquée. Néanmoins, même sous ce paradigme alternatif, le test MTT évalue toujours le potentiel de réduction d'une cellule (c'est-à-dire la disponibilité de composés réducteurs pour piloter l'énergétique cellulaire). En tant que tel, l'interprétation finale de la viabilité cellulaire reste inchangée.
En étudiant la viabilité des cellules ensemencées sur des échafaudages fibreux 3D, l'épaisseur des échafaudages peut influencer les résultats du test MTT.
Voir également
Les références
Lectures complémentaires
- Wilson AP (2000). "Chapitre 7: Cytotoxicité et viabilité". Dans Masters JR (éd.). Culture de cellules animales : une approche pratique . 1 (3e éd.). Oxford : Oxford University Press . ISBN 978-0-19-963796-6. LCCN 00026267 . OCLC 43555390 .
- Bernas T, Dobrucki J (avril 2002). "Réduction mitochondriale et non mitochondriale du MTT : interaction du MTT avec les sondes fluorescentes mitochondriales TMRE, JC-1 et NAO" . Cytométrie . 47 (4) : 236-42. doi : 10.1002/cyto.10080 . PMID 11933013 .