Numéro de copie de plasmide - Plasmid copy number

En biologie cellulaire , le nombre de copies du plasmide est le nombre de copies d'un donné plasmide dans une cellule. Pour assurer la survie et donc la propagation continue du plasmide, ils doivent réguler leur nombre de copies. Si un plasmide a un nombre de copies trop élevé, il peut surcharger son hôte de manière excessive en occupant trop de machinerie cellulaire et en utilisant trop d'énergie. D'un autre côté, un nombre de copies trop faible peut entraîner la non-présentation du plasmide dans toute la descendance de leur hôte. Les plasmides peuvent être des plasmides à nombre de copies faible, moyen ou élevé; les mécanismes de régulation entre les plasmides à faible et moyen nombre de copies sont différents. Les plasmides à faible nombre de copies (5 copies ou moins par hôte) nécessitent soit un système de partitionnement, soit une paire toxine-antitoxine telle que CcdA/CcdB pour garantir que chaque fille reçoive le plasmide. Par exemple, le plasmide F, qui est à l'origine des BAC ( bacteria artificial chromosomes ) est un plasmide à copie unique avec un système de partition codé dans un opéron juste à côté de l'origine plasmidique. Le système de partition interagit avec l'appareil de cloisonnement pour garantir que chaque fille reçoive une copie du plasmide. De nombreuses applications biotechnologiques utilisent des plasmides mutés qui se répliquent en un nombre élevé de copies. Par exemple, pBR322 est un plasmide à nombre de copies moyen (~ 20 copies/cellule) à partir duquel plusieurs vecteurs de clonage à nombre de copies élevé (> 100 copies/cellule) ont été dérivés par mutagenèse, comme la série pUC bien connue. Cela offre la commodité de rendements élevés en ADN plasmidique, mais la charge supplémentaire du nombre élevé de copies restreint la taille du plasmide. Les plus grands plasmides à copie élevée (> 30 kb) sont défavorisés et également sujets à une réduction de taille par mutagenèse par délétion.

Régulation

Les plasmides à nombre de copies moyen, également appelés plasmides relaxés, nécessitent un système garantissant que la réplication est inhibée une fois que le nombre de plasmides dans la cellule atteint un certain seuil. Les plasmides relaxés sont généralement régulés par l'un des deux mécanismes suivants : l' ARN antisens ou les groupes de liaison à l' itéron . Les plasmides à faible nombre de copies, également appelés plasmides stringents, nécessitent un contrôle plus strict de la réplication.

Plasmides dérivés de ColE1 : ARN antisens

Dans les plasmides dérivés de ColE1 , la réplication est principalement régulée par un petit ARN codé par un plasmide appelé ARN I . Un seul promoteur initie la réplication dans ColE1 : le promoteur ARN II. Le transcrit ARN II forme un hybride ARN-ADN stable avec le brin matrice d'ADN près de l'origine de réplication, où il est ensuite traité par RNaseH pour produire l' amorce 3' OH que l' ADN polymérase I utilise pour initier la synthèse d'ADN du brin principal . L'ARN I sert d'inhibiteur majeur codé par le plasmide de ce processus dont la concentration est proportionnelle au nombre de copies de plasmide. L'ARN I est exactement complémentaire de l'extrémité 5' de l'ARN II (car il est transcrit à partir du brin opposé de la même région d'ADN que l'ARN II). L'ARN I et l'ARN II dirigeaient un complexe de baisers. Le complexe de baiser est stabilisé par une protéine appelée Rop (répresseur d'amorce) et un duplex d'ARN ARN-I/ARN-II double brin est formé. Cette forme modifiée empêche l'ARN II de s'hybrider à l'ADN et d'être traité à partir de la RNaseH pour produire l'amorce nécessaire à l'initiation de la réplication du plasmide. Plus d'ARN I est produit à mesure que la concentration de plasmide augmente, ce qui inhibe de plus en plus la réplication, entraînant une régulation du nombre de copies.

Plasmides R1 et ColIb-p9 : ARN antisens

La plupart des plasmides nécessitent une protéine codée par un plasmide, généralement appelée Rep, pour séparer les brins d'ADN à l' origine de la réplication ( oriV ) afin d'initier la réplication de l'ADN. Rep se lie à des séquences d'ADN spécifiques dans oriV qui sont uniques à un type de plasmide. La synthèse de la protéine Rep est contrôlée afin de limiter la réplication plasmidique et donc de réguler le nombre de copies. Dans les plasmides R1, RepA peut être transcrit à partir de deux promoteurs différents. Il est fabriqué à partir du premier promoteur jusqu'à ce que le plasmide atteigne son nombre de copies, sur lequel la protéine CopB réprime ce promoteur primaire. L'expression de RepA est également régulée post-transcriptionnellement à partir du promoteur secondaire par un ARN antisens appelé CopA . CopA interagit avec son ARN cible dans l'ARNm de RepA et forme un complexe de baisers puis un duplex ARN-ARN. L'ARN double brin résultant est clivé par la RNase III , empêchant la synthèse de RepA. Plus la concentration du plasmide est élevée, plus l'ARN CopA est produit et moins la protéine RepA peut être synthétisée, augmentant l'inhibition de la réplication du plasmide.

Col1b-P9 : ARN antisens

La réplication du ColIb-P9 à faible nombre de copies dépend de Rep, qui est produit par l'expression du gène repZ . L' expression de repZ nécessite la formation d'un pseudo - nœud dans l'ARNm. repZ est réprimé par un petit ARN Inc antisens, qui se lie à l' ARNm repZ , forme un duplex ARN-ARNm Inc et empêche la formation du pseudo-nœud pour inhiber la traduction de repZ en Rep. Dans ce cas, la réplication ne peut plus se produire.

pSC101 : Plasmide Itéron

Les plasmides Iteron, y compris les plasmides liés à F et RK2 , ont des régions oriV contenant plusieurs (~3-7) répétitions de séquences iteron de 17-22 pb. pSC101 représente un modèle simple d'un plasmide itéron. Les plasmides Iteron contrôlent le nombre de copies grâce à deux méthodes combinées, adaptées aux plasmides stringents à faible nombre de copies. Une méthode est le contrôle de la synthèse de RepA. RepA est la seule protéine codée par un plasmide requise pour la réplication dans pSC101. La protéine RepA réprime sa propre synthèse en se liant à sa propre région promotrice et en bloquant sa propre transcription ( autorégulation transcriptionnelle ). Ainsi, plus la RepA est fabriquée, plus sa synthèse est réprimée, limitant par la suite la réplication du plasmide. L'hypothèse du couplage propose que la deuxième méthode soit le couplage de plasmides par l'intermédiaire de la protéine Rep et des séquences d'itérons. Lorsque la concentration en plasmides est élevée, les plasmides RepA liés aux itérones forment des dimères entre deux plasmides, les « menottant » à l'origine de la réplication et inhibant la réplication.

Incompatibilité

Les plasmides peuvent être incompatibles s'ils partagent le même mécanisme de contrôle de réplication. Dans ces circonstances, les deux plasmides contribuent au nombre total de copies et sont régulés ensemble. Ils ne sont pas reconnus comme des plasmides distincts. En tant que tel, il devient beaucoup plus probable que l'un des plasmides puisse être copié par l'autre et perdu pendant la division cellulaire (la cellule est "guérie" du plasmide). Ceci est particulièrement probable avec des plasmides à faible nombre de copies. Les plasmides peuvent également être incompatibles en raison de systèmes de partitionnement partagés .

Les références