Spectroscopie ultraviolette-visible - Ultraviolet–visible spectroscopy

Spectrophotomètre UV / Vis Beckman DU640

La spectroscopie ultraviolette-visible ou la spectrophotométrie ultraviolette-visible ( UV-Vis ou UV / Vis ) fait référence à la spectroscopie d'absorption ou à la spectroscopie de réflectance dans une partie de l' ultraviolet et les régions visibles complètes et adjacentes du spectre électromagnétique . Cela signifie qu'il utilise la lumière dans les plages visibles et adjacentes. L'absorption ou la réflectance dans la gamme visible affecte directement la couleur perçue des produits chimiques impliqués. Dans cette région du spectre, les atomes et les molécules subissent des transitions électroniques . La spectroscopie d'absorption est complémentaire de la spectroscopie de fluorescence , en ce que la fluorescence traite des transitions d'électrons de l' état excité à l' état fondamental , tandis que l'absorption mesure les transitions de l'état fondamental à l'état excité.

Principe de l'absorption ultraviolette-visible

Les molécules contenant des électrons de liaison et de non-liaison (n-électrons) peuvent absorber de l'énergie sous forme de lumière ultraviolette ou visible pour exciter ces électrons vers des orbitales moléculaires anti-adhérentes supérieures. Plus les électrons sont facilement excités (c'est-à-dire un écart d'énergie plus faible entre le HOMO et le LUMO ), plus la longueur d'onde de la lumière qu'il peut absorber est longue. Il existe quatre types de transitions possibles (π – π *, n – π *, σ – σ * et n – σ *), et elles peuvent être ordonnées comme suit: σ – σ *> n – σ *> π– π *> n – π *.

Applications

Un exemple de lecture UV / Vis

La spectroscopie UV / Vis est couramment utilisée en chimie analytique pour la détermination quantitative de différents analytes, tels que les ions de métaux de transition , les composés organiques hautement conjugués et les macromolécules biologiques. L'analyse spectroscopique est généralement effectuée dans des solutions, mais les solides et les gaz peuvent également être étudiés.

  • Les solutions d'ions de métaux de transition peuvent être colorées (c'est-à-dire absorber la lumière visible) car les électrons d dans les atomes métalliques peuvent être excités d'un état électronique à un autre. La couleur des solutions d'ions métalliques est fortement affectée par la présence d'autres espèces, telles que certains anions ou ligands . Par exemple, la couleur d'une solution diluée de sulfate de cuivre est un bleu très clair; l'ajout d' ammoniac intensifie la couleur et modifie la longueur d'onde d'absorption maximale (λ max ).
  • Les composés organiques , en particulier ceux avec un degré élevé de conjugaison , absorbent également la lumière dans les régions UV ou visible du spectre électromagnétique . Les solvants pour ces déterminations sont souvent l'eau pour les composés solubles dans l'eau ou l' éthanol pour les composés organiques solubles. (Les solvants organiques peuvent avoir une absorption UV significative; tous les solvants ne conviennent pas à la spectroscopie UV. L'éthanol absorbe très faiblement à la plupart des longueurs d'onde.) La polarité et le pH du solvant peuvent affecter le spectre d'absorption d'un composé organique. La tyrosine, par exemple, augmente les maxima d'absorption et le coefficient d'extinction molaire lorsque le pH augmente de 6 à 13 ou lorsque la polarité du solvant diminue.
  • Alors que les complexes de transfert de charge donnent également naissance à des couleurs, les couleurs sont souvent trop intenses pour être utilisées pour des mesures quantitatives.

La loi de Beer-Lambert stipule que l'absorbance d'une solution est directement proportionnelle à la concentration de l'espèce absorbante dans la solution et à la longueur du trajet. Ainsi, pour une longueur de trajet fixe, la spectroscopie UV / Vis peut être utilisée pour déterminer la concentration de l'absorbeur dans une solution. Il est nécessaire de savoir à quelle vitesse l'absorbance change avec la concentration. Celle-ci peut être tirée de références (tableaux de coefficients d'extinction molaire ), ou plus précisément, déterminée à partir d'une courbe d'étalonnage .

Un spectrophotomètre UV / Vis peut être utilisé comme détecteur pour HPLC . La présence d'un analyte donne une réponse supposée proportionnelle à la concentration. Pour des résultats précis, la réponse de l'instrument à l'analyte dans l'inconnu doit être comparée à la réponse à un standard; ceci est très similaire à l'utilisation de courbes d'étalonnage. La réponse (par exemple, la hauteur du pic) pour une concentration particulière est connue sous le nom de facteur de réponse .

Les longueurs d'onde des pics d'absorption peuvent être corrélées avec les types de liaisons dans une molécule donnée et sont utiles pour déterminer les groupes fonctionnels au sein d'une molécule. Les règles de Woodward – Fieser , par exemple, sont un ensemble d'observations empiriques utilisées pour prédire λ max , la longueur d'onde de l'absorption UV / Vis la plus intense, pour les composés organiques conjugués tels que les diènes et les cétones . Le spectre à lui seul n'est cependant pas un test spécifique pour un échantillon donné. La nature du solvant, le pH de la solution, la température, les concentrations élevées d'électrolyte et la présence de substances interférentes peuvent influencer le spectre d'absorption. Des variations expérimentales telles que la largeur de la fente (largeur de bande effective) du spectrophotomètre modifieront également le spectre. Pour appliquer la spectroscopie UV / Vis à l'analyse, ces variables doivent être contrôlées ou prises en compte afin d'identifier les substances présentes.

La méthode est le plus souvent utilisée de manière quantitative pour déterminer les concentrations d'une espèce absorbante en solution, en utilisant la loi de Beer-Lambert :

,

A est l' absorbance mesurée (en unités d'absorbance (AU)), est l'intensité de la lumière incidente à une longueur d'onde donnée , est l'intensité transmise, L la longueur du trajet à travers l'échantillon et c la concentration de l'espèce absorbante. Pour chaque espèce et longueur d'onde, ε est une constante connue sous le nom d' absorbance molaire ou coefficient d'extinction. Cette constante est une propriété moléculaire fondamentale dans un solvant donné, à une température et une pression particulières, et a des unités de .

L'absorbance et l'extinction ε sont parfois définies en termes de logarithme naturel au lieu du logarithme en base 10.

La loi de Beer-Lambert est utile pour caractériser de nombreux composés, mais ne constitue pas une relation universelle pour la concentration et l'absorption de toutes les substances. Une relation polynomiale de second ordre entre absorption et concentration est parfois rencontrée pour de très grandes molécules complexes telles que les colorants organiques ( Xylenol Orange ou Neutral Red , par exemple).

La spectroscopie UV – Vis est également utilisée dans l'industrie des semi-conducteurs pour mesurer l'épaisseur et les propriétés optiques de couches minces sur une plaquette. Les spectromètres UV – Vis sont utilisés pour mesurer la réflectance de la lumière et peuvent être analysés via les équations de dispersion Forouhi – Bloomer pour déterminer l'indice de réfraction (n) et le coefficient d'extinction (k) d'un film donné sur la plage spectrale mesurée.

Considérations pratiques

La loi de Beer-Lambert a des hypothèses implicites qui doivent être satisfaites expérimentalement pour qu'elle s'applique; sinon, il existe une possibilité de dérogations à la loi. Par exemple, la composition chimique et l'environnement physique de l'échantillon peuvent modifier son coefficient d'extinction. Les conditions chimiques et physiques d'un échantillon d'essai doivent donc correspondre aux mesures de référence pour que les conclusions soient valables. Dans le monde entier, les pharmacopées telles que les pharmacopées américaines (USP) et européennes (Ph. Eur.) Exigent que les spectrophotomètres fonctionnent selon des exigences réglementaires strictes englobant des facteurs tels que la lumière parasite et la précision de la longueur d'onde.

Bande passante spectrale

Il est important de disposer d'une source de rayonnement monochromatique pour la lumière incidente sur la cellule d'échantillon. La monochromaticité est mesurée comme la largeur du «triangle» formé par le pic d'intensité, à la moitié de l'intensité du pic. Un spectromètre donné a une bande passante spectrale qui caractérise la monochromatique de la lumière incidente. Si cette largeur de bande est comparable (ou supérieure à) la largeur de la raie d'absorption, alors le coefficient d'extinction mesuré sera erroné. Dans les mesures de référence, la largeur de bande de l'instrument (largeur de bande de la lumière incidente) est maintenue en dessous de la largeur des raies spectrales. Lorsqu'un matériau d'essai est mesuré, la largeur de bande de la lumière incidente doit également être suffisamment étroite. La réduction de la largeur de bande spectrale réduit l'énergie transmise au détecteur et nécessitera par conséquent un temps de mesure plus long pour obtenir le même rapport signal sur bruit.

Erreur de longueur d'onde

Dans les liquides, le coefficient d'extinction change généralement lentement avec la longueur d'onde. Un pic de la courbe d'absorbance (une longueur d'onde où l'absorbance atteint un maximum) est l'endroit où le taux de changement d'absorbance avec la longueur d'onde est le plus petit. Les mesures sont généralement effectuées à un pic pour minimiser les erreurs produites par des erreurs de longueur d'onde dans l'instrument, c'est-à-dire des erreurs dues à un coefficient d'extinction différent de celui supposé.

Lumière parasite

Un autre facteur important est la pureté de la lumière utilisée. Le facteur le plus important affectant ceci est le niveau de lumière parasite du monochromateur .

Le détecteur utilisé est à large bande; il répond à toute la lumière qui l'atteint. Si une quantité significative de lumière passée à travers l'échantillon contient des longueurs d'onde qui ont des coefficients d'extinction beaucoup plus faibles que le nominal, l'instrument signalera une absorbance incorrectement faible. Tout instrument atteindra un point où une augmentation de la concentration de l'échantillon n'entraînera pas une augmentation de l'absorbance rapportée, car le détecteur répond simplement à la lumière parasite. En pratique, la concentration de l'échantillon ou la longueur du chemin optique doit être ajustée pour placer l'absorbance inconnue dans une plage valable pour l'instrument. Parfois, une fonction d'étalonnage empirique est développée, en utilisant des concentrations connues de l'échantillon, pour permettre des mesures dans la région où l'instrument devient non linéaire.

À titre indicatif, un instrument avec un seul monochromateur aurait généralement un niveau de lumière parasite correspondant à environ 3 unités d'absorbance (AU), ce qui rendrait les mesures supérieures à environ 2 UA problématiques. Un instrument plus complexe avec un double monochromateur aurait un niveau de lumière parasite correspondant à environ 6 UA, ce qui permettrait donc de mesurer une plage d'absorbance beaucoup plus large.

Écarts par rapport à la loi de Beer-Lambert

À des concentrations suffisamment élevées, les bandes d'absorption satureront et montreront un aplatissement d'absorption. Le pic d'absorption semble s'aplatir car près de 100% de la lumière est déjà absorbée. La concentration à laquelle cela se produit dépend du composé particulier mesuré. Un test qui peut être utilisé pour tester cet effet est de faire varier la longueur du trajet de la mesure. Dans la loi de Beer-Lambert, la variation de la concentration et de la longueur du trajet a un effet équivalent - diluer une solution d'un facteur 10 a le même effet que de raccourcir la longueur du trajet d'un facteur 10. Si des cellules de différentes longueurs de trajet sont disponibles, tester si cette relation est vraie, c'est une façon de juger si l'aplatissement de l'absorption se produit.

Les solutions non homogènes peuvent présenter des écarts par rapport à la loi de Beer-Lambert en raison du phénomène d'aplatissement de l'absorption. Cela peut se produire, par exemple, lorsque la substance absorbante est située dans des particules en suspension. Les écarts seront les plus visibles dans des conditions de faible concentration et d'absorbance élevée. La dernière référence décrit un moyen de corriger cet écart.

Certaines solutions, comme le chlorure de cuivre (II) dans l'eau, changent visuellement à une certaine concentration en raison des conditions modifiées autour de l'ion coloré (l'ion cuivre divalent). Pour le chlorure de cuivre (II), cela signifie un passage du bleu au vert, ce qui signifierait que les mesures monochromatiques s'écarteraient de la loi de Beer-Lambert.

Sources d'incertitude de mesure

Les facteurs ci-dessus contribuent à l' incertitude de mesure des résultats obtenus avec la spectrophotométrie UV / Vis. Si la spectrophotométrie UV / Vis est utilisée dans l'analyse chimique quantitative, les résultats sont en outre affectés par des sources d'incertitude découlant de la nature des composés et / ou des solutions qui sont mesurés. Il s'agit notamment des interférences spectrales causées par le chevauchement des bandes d'absorption, la décoloration de la couleur de l'espèce absorbante (causée par la décomposition ou la réaction) et une éventuelle discordance de composition entre l'échantillon et la solution d'étalonnage.

Spectrophotomètre ultraviolet-visible

L' instrument utilisé en spectroscopie ultraviolette-visible est appelé spectrophotomètre UV / Vis . Il mesure l'intensité de la lumière après avoir traversé un échantillon ( ), et la compare à l'intensité de la lumière avant qu'elle ne traverse l'échantillon ( ). Le rapport est appelé la transmittance et est généralement exprimé en pourcentage (% T). L' absorbance , est basée sur la transmission:

Le spectrophotomètre UV-visible peut également être configuré pour mesurer la réflectance. Dans ce cas, le spectrophotomètre mesure l'intensité de la lumière réfléchie par un échantillon ( ) et la compare à l'intensité de la lumière réfléchie par un matériau de référence ( ) (tel qu'un carreau blanc). Le rapport est appelé réflectance et est généralement exprimé en pourcentage (% R).

Les éléments de base d'un spectrophotomètre sont une source de lumière, un support pour l'échantillon, un réseau de diffraction dans un monochromateur ou un prisme pour séparer les différentes longueurs d'onde de la lumière et un détecteur. La source de rayonnement est souvent un filament de tungstène (300–2500 nm), une lampe à arc au deutérium , qui est continue sur la région ultraviolette (190–400 nm), une lampe à arc au xénon , qui est continue de 160 à 2 000 nm; ou plus récemment, des diodes électroluminescentes (LED) pour les longueurs d'onde visibles. Le détecteur est typiquement un tube photomultiplicateur , une photodiode , un réseau de photodiodes ou un dispositif à couplage de charge (CCD). Des détecteurs à photodiode unique et des tubes photomultiplicateurs sont utilisés avec des monochromateurs à balayage, qui filtrent la lumière de sorte que seule la lumière d'une seule longueur d'onde atteigne le détecteur à la fois. Le monochromateur à balayage déplace le réseau de diffraction pour "faire défiler" chaque longueur d'onde de sorte que son intensité puisse être mesurée en fonction de la longueur d'onde. Les monochromateurs fixes sont utilisés avec les capteurs CCD et les matrices de photodiodes. Comme ces deux dispositifs sont constitués de nombreux détecteurs regroupés en réseaux à une ou deux dimensions, ils sont capables de collecter de la lumière de différentes longueurs d'onde sur différents pixels ou groupes de pixels simultanément.

Schéma simplifié d'un spectrophotomètre UV-visible à double faisceau

Un spectrophotomètre peut être à faisceau unique ou à double faisceau . Dans un instrument à faisceau unique (tel que le Spectronic 20 ), toute la lumière passe à travers la cellule d'échantillonnage. doit être mesurée en retirant l'échantillon. C'était la conception la plus ancienne et elle est toujours utilisée dans les laboratoires d'enseignement et industriels.

Dans un instrument à double faisceau, la lumière est divisée en deux faisceaux avant d'atteindre l'échantillon. Un faisceau est utilisé comme référence; l'autre faisceau traverse l'échantillon. L'intensité du faisceau de référence est considérée comme une transmission de 100% (ou 0 absorbance) et la mesure affichée est le rapport des deux intensités du faisceau. Certains instruments à double faisceau ont deux détecteurs (photodiodes), et l'échantillon et le faisceau de référence sont mesurés en même temps. Dans d'autres instruments, les deux faisceaux passent à travers un hacheur de faisceaux , qui bloque un faisceau à la fois. Le détecteur alterne entre la mesure du faisceau échantillon et du faisceau de référence en synchronisme avec le hacheur. Il peut également y avoir un ou plusieurs intervalles d'obscurité dans le cycle du hacheur. Dans ce cas, les intensités de faisceau mesurées peuvent être corrigées en soustrayant l'intensité mesurée dans l'intervalle d'obscurité avant que le rapport ne soit pris.

Dans un instrument à faisceau unique, la cuvette ne contenant qu'un solvant doit d'abord être mesurée. Mettler Toledo a développé un spectrophotomètre à faisceau unique qui permet des mesures rapides et précises sur la gamme UV / VIS. La source de lumière est constituée d'une lampe flash au xénon pour l'ultraviolet (UV) ainsi que pour les régions de longueur d'onde visible (VIS) et proche infrarouge couvrant une gamme spectrale de 190 à 1100 nm. Les flashs de la lampe sont focalisés sur une fibre de verre qui entraîne le faisceau de lumière sur une cuvette contenant la solution échantillon. Le faisceau traverse l'échantillon et des longueurs d'onde spécifiques sont absorbées par les composants de l'échantillon. La lumière restante est collectée après la cuvette par une fibre de verre et entraînée dans un spectrographe. Le spectrographe se compose d'un réseau de diffraction qui sépare la lumière en différentes longueurs d'onde, et d'un capteur CCD pour enregistrer les données, respectivement. L'ensemble du spectre est ainsi mesuré simultanément, ce qui permet un enregistrement rapide.

Les échantillons pour la spectrophotométrie UV / Vis sont le plus souvent des liquides, bien que l'absorbance des gaz et même des solides puisse également être mesurée. Les échantillons sont généralement placés dans une cellule transparente , appelée cuvette . Les cuvettes sont généralement de forme rectangulaire, généralement avec une largeur interne de 1 cm. (Cette largeur devient la longueur du trajet,, dans la loi de Beer-Lambert.) Les tubes à essai peuvent également être utilisés comme cuvettes dans certains instruments. Le type de conteneur d'échantillon utilisé doit permettre au rayonnement de passer au-dessus de la région spectrale d'intérêt. Les cuvettes les plus largement utilisées sont fabriquées en silice fondue ou en verre de quartz de haute qualité car elles sont transparentes dans toutes les régions UV, visible et proche infrarouge. Les cuves en verre et en plastique sont également courantes, bien que le verre et la plupart des plastiques absorbent les UV, ce qui limite leur utilité aux longueurs d'onde visibles.

Des instruments spécialisés ont également été fabriqués. Il s'agit notamment de fixer des spectrophotomètres aux télescopes pour mesurer les spectres des caractéristiques astronomiques. Les microspectrophotomètres UV-visible consistent en un microscope UV-visible intégré à un spectrophotomètre UV-visible.

Un spectre complet de l'absorption à toutes les longueurs d'onde d'intérêt peut souvent être produit directement par un spectrophotomètre plus sophistiqué. Dans les instruments plus simples, l'absorption est déterminée une longueur d'onde à la fois, puis compilée dans un spectre par l'opérateur. En supprimant la dépendance à la concentration, le coefficient d'extinction (ε) peut être déterminé en fonction de la longueur d'onde.

Microspectrophotométrie

La spectroscopie UV-visible d'échantillons microscopiques est réalisée en intégrant un microscope optique avec une optique UV-visible, des sources de lumière blanche, un monochromateur et un détecteur sensible tel qu'un dispositif à couplage de charge (CCD) ou un tube photomultiplicateur (PMT). Comme un seul chemin optique est disponible, il s'agit d'instruments à faisceau unique. Les instruments modernes sont capables de mesurer les spectres UV-visible en réflectance et en transmission des zones d'échantillonnage à l'échelle du micron. Les avantages de l'utilisation de tels instruments sont qu'ils sont capables de mesurer des échantillons microscopiques mais sont également capables de mesurer les spectres d'échantillons plus grands avec une résolution spatiale élevée. En tant que tels, ils sont utilisés dans le laboratoire médico-légal pour analyser les colorants et les pigments dans les fibres textiles individuelles, les éclats de peinture microscopiques et la couleur des fragments de verre. Ils sont également utilisés dans la science des matériaux et la recherche biologique et pour déterminer le contenu énergétique du charbon et de la roche mère de pétrole en mesurant la réflectance de la vitrinite . Les microspectrophotomètres sont utilisés dans les industries des semi-conducteurs et de la micro-optique pour contrôler l'épaisseur des couches minces après leur dépôt. Dans l'industrie des semi-conducteurs, ils sont utilisés car les dimensions critiques des circuits sont microscopiques. Un test typique d'une tranche semi-conductrice impliquerait l'acquisition de spectres à partir de nombreux points sur une tranche à motif ou sans motif. L'épaisseur des films déposés peut être calculée à partir du motif d'interférence des spectres. En outre, la spectrophotométrie ultraviolette-visible peut être utilisée pour déterminer l'épaisseur, ainsi que l'indice de réfraction et le coefficient d'extinction des couches minces comme décrit dans Indice de réfraction et coefficient d'extinction des matériaux à couche mince . Une carte de l'épaisseur du film sur toute la tranche peut ensuite être générée et utilisée à des fins de contrôle de qualité.

Applications supplémentaires

UV / Vis peut être appliqué pour déterminer la cinétique ou la constante de vitesse d'une réaction chimique . La réaction, se produisant en solution, doit présenter des changements de couleur ou de luminosité des réactifs aux produits afin d'utiliser UV / Vis pour cette application. Par exemple, la molécule de dithizonate de mercure est de couleur jaune-orange en solution diluée (1 * 10 ^ -5 M), et devient bleue lorsqu'elle est soumise à des longueurs d'onde particulières de lumière visible (et UV) via un changement de conformation, mais cette réaction est réversible à l'état "fondamental" jaune.

En utilisant des fibres optiques comme élément de transmission du spectre des gaz brûlés, il est possible de déterminer la composition chimique d'un carburant, la température des gaz et le rapport air-carburant.

La constante de vitesse d'une réaction particulière peut être déterminée en mesurant le spectre d'absorbance UV / Vis à des intervalles de temps spécifiques. En utilisant à nouveau le dithizonate de mercure comme exemple, on peut éclairer l'échantillon pour rendre la solution bleue, puis exécuter un test UV / Vis toutes les 10 secondes (variable) pour voir les niveaux de longueurs d'onde absorbées et réfléchies changer au fil du temps conformément à la solution retournant au jaune à partir de l'état d'énergie bleue excitée. À partir de ces mesures, la concentration des deux espèces peut être calculée. La réaction du dithizonate de mercure d'une conformation à une autre est de premier ordre et aurait la loi de vitesse intégrale du premier ordre: ln [A] (temps t) = - kt + ln [A] (initial). Par conséquent, la représentation graphique du logarithme naturel (ln) de la concentration [A] en fonction du temps représentera une ligne avec la pente -k, ou négativement la constante de vitesse. Différents ordres de vitesse ont différentes lois de vitesse intégrées en fonction du mécanisme de la réaction.

Une constante d'équilibre peut également être calculée avec la spectroscopie UV / Vis. Après avoir déterminé les longueurs d'onde optimales pour toutes les espèces impliquées dans les équilibres, une réaction peut être exécutée jusqu'à l' équilibre et la concentration des espèces déterminée par spectroscopie à diverses longueurs d'onde connues. La constante d'équilibre peut être calculée comme K (eq) = [Produits] / [Réactifs].

Voir également

Les références