Séquençage solide ABI - ABI Solid Sequencing

Article principal: encodage 2 bases
Préparation de la bibliothèque pour la plateforme SOLiD
Schéma de codage à deux bases. Dans le codage à deux bases, chaque paire unique de bases à l'extrémité 3 'de la sonde se voit attribuer une des quatre couleurs possibles. Par exemple, "AA" est attribué au bleu, "AC" est attribué au vert, et ainsi de suite pour les 16 paires uniques. Pendant le séquençage, chaque base du modèle est séquencée deux fois et les données résultantes sont décodées selon ce schéma.

SOLiD (Sequencing by Oligonucléotide Ligation and Detection) est une technologie de séquençage d'ADN de nouvelle génération développée par Life Technologies et est disponible dans le commerce depuis 2006. Cette technologie de nouvelle génération génère 10 8 - 10 9 lectures de petites séquences à la fois. Il utilise un codage à 2 bases pour décoder les données brutes générées par la plate-forme de séquençage en données de séquence.

Cette méthode ne doit pas être confondue avec le «séquençage par synthèse», principe utilisé par le pyroséquençage Roche-454 (introduit en 2005, générant des millions de lectures de 200 à 400 pb en 2009), et le système Solexa (désormais propriété d'Illumina) (introduit dans 2006, générant des centaines de millions de lectures de 50 à 100 pb en 2009)

Ces méthodes ont réduit le coût de 0,01 USD / base en 2004 à près de 0,0001 USD / base en 2006 et augmenté la capacité de séquençage de 1 000 000 bases / machine / jour en 2004 à plus de 5 000 000 000 bases / machine / jour en 2009. Il existe plus de 30 publications décrivant son utilisation d'abord pour le positionnement de nucléosomes de Valouev et al., le profilage transcriptionnel ou RNA-Seq sensible au brin avec Cloonan et al., le profilage transcriptionnel unicellulaire avec Tang et al. et finalement le reséquençage humain avec McKernan et al.

Il a été rapporté que la méthode utilisée par cette machine (séquençage par ligature) pose des problèmes de séquençage des séquences palindromiques.

Chimie

Une banque de fragments d'ADN est préparée à partir de l'échantillon à séquencer, et est utilisée pour préparer des populations de billes clonales. C'est-à-dire qu'une seule espèce de fragment sera présente à la surface de chaque bille magnétique. Les fragments attachés aux billes magnétiques auront une séquence d'adaptateur P1 universelle attachée de sorte que la séquence de départ de chaque fragment soit à la fois connue et identique. La PCR en émulsion a lieu dans des microréacteurs contenant tous les réactifs nécessaires à la PCR. Les billes avec les produits de PCR résultants sont déposées sur une lame de verre.

Les amorces s'hybrident à la séquence de l'adaptateur P1 dans le modèle de bibliothèque. Un ensemble de quatre sondes di-base marquées par fluorescence entrent en compétition pour la ligature à l'amorce de séquençage. La spécificité de la sonde di-base est obtenue en interrogeant chaque 1ère et 2ème base dans chaque réaction de ligature. Plusieurs cycles de ligature, de détection et de clivage sont effectués avec le nombre de cycles déterminant la longueur de lecture éventuelle. Après une série de cycles de ligature, le produit d'extension est retiré et la matrice est réinitialisée avec une amorce complémentaire à la position n-1 pour un deuxième cycle de cycles de ligature.

Cinq cycles de réinitialisation de l'amorce sont terminés pour chaque étiquette de séquence. Grâce au processus de réinitialisation des amorces, chaque base est interrogée dans deux réactions de ligature indépendantes par deux amorces différentes. Par exemple, la base en position de lecture 5 est dosée par l'amorce numéro 2 dans le cycle de ligature 2 et par l'amorce numéro 3 dans le cycle de ligature 1.

Débit et précision

Selon ABI, la plate-forme SOLiD 3plus fournit 60 gigabases de données ADN utilisables par cycle. En raison du système de codage à deux bases, un contrôle de précision inhérent est intégré à la technologie et offre une précision de 99,94%. La chimie des systèmes signifie également qu'il n'est pas gêné par les homopolymères contrairement au système Roche 454 FLX et que les régions de répétition d'homopolymère si grandes et difficiles ne sont plus un problème à séquencer.

Applications

Naturellement, la technologie sera utilisée pour séquencer l'ADN, mais en raison de la nature hautement parallèle de toutes les technologies de prochaine génération, elles ont également des applications en transcriptomique et en épigénomique .

Les microréseaux étaient autrefois le pilier de la transcriptomique au cours des dix dernières années et la technologie basée sur les tableaux s'est par la suite étendue à d'autres domaines. Cependant, ils sont limités en ce que seules les informations peuvent être obtenues pour les sondes qui se trouvent sur la puce. Seules les informations sur les organismes pour lesquels des puces sont disponibles peuvent être obtenues, et elles présentent tous les problèmes d'hybridation d'un grand nombre de molécules (températures d'hybridation différentes). La transcriptomique RNA-Seq par le séquençage de la prochaine génération signifiera que ces barrières ne seront plus vraies. Le transcriptome entier de tout organisme pourrait être potentiellement séquencé en une seule fois (pour de très petits génomes bactériens) et non seulement l'identification de chaque transcrit serait disponible, mais le profilage d'expression est possible car des lectures quantitatives peuvent également être réalisées.

L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est une méthode pour déterminer les sites de liaison des facteurs de transcription et les interactions ADN-protéines. Dans le passé, il a été combiné avec la technologie des tableaux (ChIP-chip) avec un certain succès. Le séquençage de nouvelle génération peut également être appliqué dans ce domaine. L'immunoprécipitation de méthylation (MeDIP) peut également être réalisée et également sur des tableaux.

La capacité d'en apprendre davantage sur la méthylation et les sites de liaison du TF à l'échelle du génome est une ressource précieuse et pourrait nous en apprendre beaucoup sur la maladie et la biologie moléculaire en général.

Voir également

Les références

Lectures complémentaires