Processus Cohn - Cohn process
Le procédé Cohn , développé par Edwin J. Cohn , est une série d'étapes de purification dans le but d'extraire l' albumine du plasma sanguin . Le processus est basé sur la solubilité différentielle de l'albumine et d'autres protéines plasmatiques en fonction du pH , de la concentration d' éthanol , de la température, de la force ionique et de la concentration des protéines. L'albumine a la solubilité la plus élevée et le point isoélectrique le plus bas de toutes les principales protéines plasmatiques. Cela en fait le produit final à précipiter ou à séparer de sa solution sous forme solide. L'albumine était un excellent substitut au plasma humain pendant la Seconde Guerre mondiale. Lorsqu'il est administré à des soldats blessés ou à d'autres patients ayant subi une perte de sang, il contribue à augmenter le volume de sang et accélère la guérison. La méthode de Cohn était suffisamment douce pour que la protéine d'albumine isolée conserve son activité biologique .
Détails du processus
Au cours des opérations, la concentration en éthanol passe de zéro initialement à 40%. Le pH diminue de neutre à 7 à plus acide à 4,8 au cours du fractionnement. La température commence à température ambiante et diminue jusqu'à -5 degrés Celsius. Au départ, le sang est gelé. Il y a cinq fractions principales. Chaque fraction se termine par un précipité spécifique. Ces précipités sont les fractions séparées.
Les fractions I, II et III sont précipitées à des stades précoces. Les conditions des étapes antérieures sont 8% d'éthanol, pH 7,2, -3 ° C et 5,1% de protéines pour la fraction I; 25% d'éthanol, pH de 6,9, -5 ° C et 3% de protéines. L'albumine reste dans la fraction surnageante lors de la séparation solide / liquide dans ces conditions. La fraction IV contient plusieurs protéines indésirables qui doivent être éliminées. Pour ce faire, les conditions sont variées afin de précipiter les protéines. Les conditions de précipitation de ces protéines augmentent la concentration en éthanol de 18 à 40% et le pH de 5,2 à 5,8. Enfin, l'albumine se situe dans la fraction V. La précipitation de l'albumine se fait en réduisant le pH à 4,8, qui est proche du pi de la protéine, et en maintenant la concentration en éthanol à 40%, avec une concentration en protéines de 1%. Ainsi, seulement 1% du plasma d'origine reste dans la cinquième fraction.
Cependant, l'albumine est perdue à chaque étape du processus, avec environ 20% de l'albumine perdue par les étapes de précipitation avant la fraction V.Afin de purifier l'albumine, il y a une extraction avec de l'eau et un ajustement à 10% d'éthanol, pH de 4,5 à −3 ° C. Tout précipité formé ici se fait par filtration et est une impureté. Ces précipités sont rejetés. La reprécipitation, ou la répétition de l'étape de précipitation afin d'améliorer la pureté, se fait en augmentant la concentration d'éthanol à 40% à partir de l'étape d'extraction. Le pH est de 5,2 et il est conduit à -5 ° C. Plusieurs variantes de la fraction Cohn ont été créées pour tenir compte d'un coût inférieur et d'un rendement plus élevé. En général, si le rendement est élevé, la pureté est abaissée, à environ 85-90%.
| Fraction #: | Fraction I | Fraction II | Fraction III | Fraction IV | Fraction V |
|---|---|---|---|---|---|
| Éthanol%: | 8 | 25 | 18 | 40 | 40 |
| pH: | 7,2 | 6,9 | 5.2 | 5,8 | 4,8 |
| Température (° C) | −3 | −5 | −5 | −5 | −5 |
| Fraction protéique (%): | 5.1 | 3 | 3 | 3 | 1 |
Produits autres que l'albumine
Cohn a pu démarrer le laboratoire de fractionnement du plasma après avoir reçu un financement massif des agences gouvernementales et des sociétés pharmaceutiques privées. Cela a conduit au fractionnement du plasma humain. Le plasma humain s'est avéré avoir plusieurs composants utiles autres que l'albumine. Le fractionnement du plasma sanguin humain a donné de l'albumine sérique humaine , de la gamma globuline sérique , du fibrinogène , de la thrombine et des globulines de groupe sanguin. Les fractions de fibrinogène et de thrombine ont été en outre combinées pendant la guerre en produits supplémentaires, y compris un scellant de fibrine liquide , une mousse de fibrine solide et un film de fibrine. Les gamma globulines se trouvent dans les fractions II et III et se sont avérées essentielles dans le traitement de la rougeole chez les soldats. La gamma globuline était également utile dans le traitement de la polio, mais n'avait pas beaucoup d'effet dans le traitement des oreillons ou de la scarlatine. Plus important encore, les gamma globulines ont été utiles pour modifier et prévenir l'hépatite infectieuse pendant la Seconde Guerre mondiale. Il est finalement devenu un traitement pour les enfants exposés à ce type d'hépatite.
Un scellant de fibrine liquide a été utilisé dans le traitement des victimes de brûlures, y compris certaines de l'attaque de Pearl Harbor, pour attacher des greffes de peau avec un taux de réussite accru. Il s'est également avéré utile pour reconnecter ou anastomoser les nerfs sectionnés. La mousse de fibrine et la thrombine ont été utilisées pour contrôler le suintement des vaisseaux sanguins, en particulier dans les lésions hépatiques et à proximité des tumeurs. Il a également minimisé les saignements des grosses veines ainsi que le traitement des malformations des vaisseaux sanguins dans le cerveau. Un film de fibrine a été utilisé pour arrêter le saignement dans diverses applications chirurgicales, y compris la neurochirurgie. Cependant, il n'a pas été utile pour contrôler les saignements artériels. Le premier produit à base de fibrinogène / fibrine capable d'arrêter l'hémorragie artérielle a été le «Fibrin Sealant Bandage» ou «Hemostatic Dressing (HD)» inventé par Martin MacPhee à la Croix-Rouge américaine au début des années 1990 et testé en collaboration avec l'armée américaine.
Variations de processus
La méthode Gerlough, développée en 1955, a amélioré l'économie du procédé en réduisant la consommation d'éthanol. Au lieu de 40% dans certaines étapes, Gerlough a utilisé 20% d'éthanol pour la précipitation. Ceci est particulièrement utilisé pour les fractions II et III. De plus, Gerlough a combiné les deux fractions avec IV en une seule étape pour réduire le nombre de fractionnements requis. Bien que cette méthode se soit avérée moins coûteuse, elle n'a pas été adoptée par l'industrie en raison de cette combinaison des fractions II, III et IV, par crainte du mélange et des impuretés élevées.
La méthode Hink mise au point en 1957. Cette méthode a donné des rendements plus élevés grâce à la récupération de certaines des protéines plasmatiques rejetées dans les fractions IV. Les rendements améliorés, cependant, équilibrés par les puretés inférieures obtenues, dans la plage de 85%.
La méthode de Mulford, semblable au Hink, utilisait les fractions II et III du surnageant comme dernière étape avant la finition et le traitement thermique. La méthode combinait les fractions IV et V, mais dans ce cas, l'albumine ne serait pas aussi pure, bien que les rendements puissent être plus élevés.
Une autre variante a été développée par Kistler et Nitschmann, pour fournir une forme plus pure d'albumine, même si compensée par des rendements inférieurs. Semblable à Gerlough, le précipité A, qui équivaut aux Fractions II et III de Cohn, a été réalisé à une concentration d'éthanol inférieure de 19%, mais le pH, dans ce cas, était également inférieur à 5,85. Également similaire à Gerlough et Mulford, la fraction IV a été combinée et précipitée dans des conditions d'éthanol à 40%, pH de 5,85 et température de -8 degrés C.L'albumine, qui est récupérée dans la fraction V, est récupérée dans le précipité C à un Ajustement du pH à 4,8. Semblable au procédé Cohn, l'albumine est purifiée par extraction dans l'eau suivie de la précipitation des impuretés à 10% d'éthanol, pH 4,6 et -3 degrés C.Semblable au procédé Cohn, le précipité formé ici est filtré et jeté. Puis le précipité C (fraction V) est reprécipité à pH 5,2 et stocké sous forme de pâte à -40 ° C. Ce procédé a été plus largement accepté car il sépare les fractions et rend chaque étage indépendant les uns des autres.
| Précipité: | UNE | B | C |
|---|---|---|---|
| Éthanol%: | 19 | 40 | 40 |
| pH: | 5,85 | 5,85 | 4,8 |
| Température (degs C) | −3 | −8 | −8 |
Une autre variante impliquait un fractionnement thermique à l'éthanol. Il a été développé à l'origine pour inactiver le virus de l'hépatite. Dans ce processus, la récupération d'albumine à haut rendement et de haute pureté est l'objectif le plus important, tandis que les autres protéines plasmatiques sont négligées. Afin de s'assurer que l'albumine ne se dénature pas à la chaleur, il existe des stabilisants tels que l'octanoate de sodium, qui permettent à l'albumine de tolérer des températures plus élevées pendant de longues périodes. Dans l'éthanol thermique, le plasma est traité thermiquement à 68 ° C avec de l'octanoate de sodium avec 9% d'éthanol à pH 6,5. Il en résulte une récupération améliorée de l'albumine avec des rendements de 90% et des puretés de 100%. Ce n'est pas aussi cher que les procédures à l'éthanol froid telles que le procédé Cohn. Un inconvénient est la présence de nouveaux antigènes en raison d'une possible dénaturation thermique de l'albumine. De plus, les autres protéines plasmatiques ont des utilisations pratiques et les négliger n'en vaudrait pas la peine. Enfin, les cuves de traitement thermique coûteuses compensent le coût inférieur par rapport au format éthanol froid qui n'en a pas besoin. Pour ces raisons, plusieurs entreprises n'ont pas adopté cette méthode même si elle donne les résultats les plus impressionnants. Cependant, une organisation importante qui l'utilise est la Croix-Rouge allemande.
La dernière variation a été développée par Hao en 1979. Cette méthode est considérablement simplifiée par rapport au procédé Cohn. Son objectif est de créer des rendements élevés en albumine tant que l'albumine est le seul produit. Grâce à un processus en deux étapes, les impuretés sont précipitées directement à partir du surnageant des fractions II et III à 42% d'éthanol, pH 5,8, température -5 degrés C, 1,2% de protéines et 0,09 force ionique. La fraction V est précipitée à pH 4,8. Les fractions I, II, III et IV sont coprécipitées à 40% d'éthanol, avec un pH de 5,4 à 7,0, et une température de -3 à -7 degrés C.La fraction V est ensuite précipitée à pH 4,8 et -10 degrés C. sont dus à une combinaison d'un processus simplifié, avec des pertes plus faibles dues à la coprécipitation, et l'utilisation de la filtration. Des puretés plus élevées ont également été atteintes à 98% en raison des niveaux d'éthanol plus élevés, mais les rendements ont été abaissés avec la pureté élevée.
Des méthodes plus récentes impliquent l'utilisation de la chromatographie .
Influences du processus Cohn
Le procédé Cohn a été un développement majeur dans le domaine du fractionnement du sang. Il a plusieurs utilisations pratiques dans le traitement de maladies telles que l'hépatite et la polio. Il a été très utile pendant la Seconde Guerre mondiale, où les soldats se sont rétablis plus rapidement en raison des transfusions d'albumine. Le processus Cohn a été modifié au fil des ans, comme indiqué ci-dessus. En outre, il a influencé d'autres processus avec l'industrie du fractionnement du sang. Cela a conduit à de nouvelles formes de fractionnement telles que le fractionnement chromatographique du plasma dans les processus d'échange d'ions et de finition à l'albumine. En général, le procédé Cohn et ses variantes ont donné un énorme coup de pouce et servent de base à l'industrie du fractionnement à ce jour.
Cependant, le processus n'a pas été bien étudié car il est archaïque. Plus important encore, il n'a jamais été modernisé par les entreprises manufacturières. Le format d'éthanol froid peut être trop doux pour tuer certains virus qui nécessitent une inactivation par la chaleur. Étant donné que ce processus reste inchangé pendant si longtemps, plusieurs inefficacités et incohérences intégrées affectent l'économie du processus pour les entreprises pharmaceutiques et de fabrication. Une exception à cette règle était l'application en Écosse du traitement en flux continu au lieu du traitement par lots. Ce processus a été conçu au Protein Fractionation Center (PFC), l'installation de fractionnement du plasma du Scottish National Blood Transfusion Service (SNBTS). Ce processus impliquait une surveillance et un contrôle en ligne du pH et de la température, avec un contrôle du débit des flux de plasma et d'éthanol à l'aide de pompes à engrenages de précision, le tout sous contrôle de rétroaction informatisé. En conséquence, les fractions Cohn I + II + III, IV et V ont été produites en quelques heures plutôt qu'en plusieurs jours. La préparation en flux continu de cryoprécipité a ensuite été intégrée dans le procédé en amont du fractionnement de Cohn.
Néanmoins, ce processus sert toujours de base majeure pour l'industrie du sang en général et son influence peut être vue comme on l'appelle dans le développement de nouvelles méthodes. Bien qu'il ait ses inconvénients en fonction de la variation, le principal avantage du procédé Cohn réside dans ses utilisations pratiques et son utilité dans les industries pharmacologiques et médicales.