Nucléase du haricot mungo - Mung bean nuclease

La nucléase du haricot mungo ( Nuclease MB ) est une nucléase dérivée de germes de haricot mungo ( Vigna radiata ) qui élimine les nucléotides de manière progressive des molécules d' ADN simple brin (ADNsb) et est utilisée dans des applications biotechnologiques pour éliminer cet ADNsb de un mélange contenant également de l' ADN double brin (ADNdb). Cette enzyme est utile pour la cartographie des transcriptions, l'élimination des régions simple brin dans les hybrides d'ADN ou les surplombs simple brin produits par les enzymes de restriction , etc. Elle a une activité similaire à la Nuclease S1 (les deux sont EC 3.1.30.1), mais elle a une activité plus élevée. spécificité pour les molécules simple brin.

L'enzyme dégrade l'ADN ou l'ARN simple brin en nucléoside 5'-monophosphates, mais ne digère pas l'ADN double brin, l'ARN double brin ou les hybrides ADN / ARN. La nucléase de haricot mungo catalyse la dégradation spécifique de l'ADN ou de l'ARN simple brin et produit des mono et oligonucléotides portant une extrémité 5'-P. La nucléase du haricot mungo a une spécificité simple brin stricte pour l'ADN ou l'ARN.

La nucléase du haricot mungo a un poids moléculaire estimé de 39 kDa par SDS-PAGE . Une glycoprotéine, 29% de cette masse sont des sucres. En avril 2019, le gène spécifique codant pour cette protéine est inconnu, et toute la production repose sur un processus de purification sur des germes de soja de 1980. Certains sont connus sur sa structure, avec un résidu Cystéine exposé et 3 paires de liaisons disulfure. Certains sont connus sur sa composition en acides aminés .

Exigences

La nucléase du haricot mungo nécessite du Zn ²⁺ . L'ajout d' EDTA ou de SDS provoque une inactivation irréversible. La nucléase du haricot mungo n'est pas active à un pH inférieur à 4,6, ni à une faible concentration en sel.

La description

Nuclease MB est une exo-endonucléase d' ADN et d'ARN spécifique qui dégradera les extensions simple brin des extrémités des molécules d'ADN et d'ARN, laissant des extrémités franches pouvant être ligaturées. Sa spécificité monocaténaire plus élevée en fait l'enzyme de choix pour la plupart des applications nécessitant une nucléase spécifique monocaténaire.

Contrairement à la nucléase S1, la nucléase du haricot mungo ne clive pas le brin intact de l'ADN duplex entaillé.

Sa capacité à reconnaître les acides nucléiques double brin dépend de la séquence de base.

Il a tendance à se cliver à ApN et à T (U) pN. Il dégrade complètement ApA, mais ne dégrade pas G et C. Contrairement à la nucléase S1, il ne coupe pas le brin opposé à celui qui a été entaillé.

La nucléase du haricot mungo catalyse la dégradation spécifique de l'ADN ou de l'ARN simple brin et produit des mono- et oligonucléotides portant une extrémité 5'-P.

Une quantité plus de 1000 fois d'enzyme peut dégrader l'oligomère en tous les mononucléotides.

Un excès de l'enzyme est nécessaire pour dégrader les hybrides ADN ou ARN double brin et ADN-ARN, et dans ce cas, les régions riches en AT sont sélectivement dégradées.

Cette enzyme fonctionne bien aux sites A ↓ pN, T ↓ pN, et en particulier les sites A ↓ pN sont dégradés à 100%.

Cependant, il est difficile de dégrader le site C ↓ pC, C ↓ pG.

L'exonucléase de haricot mungo est une nucléase dérivée de haricots mungo qui élimine les nucléotides de manière progressive des molécules d'ADN simple brin et est utilisée pour éliminer cet ADNsb d'un mélange contenant également de l'ADN double brin (ADNdb).

Définition de l'unité:

Une unité de nucléase de haricot mungo convertit 1 pg d'ADN de thymus de veau dénaturé par la chaleur en une forme soluble dans l'acide en 1 minute à 37 ° C dans des conditions d'essai standard.

Applications en biotechnologie et recherche biochimique

• Élimination des boucles en épingle à cheveux lors de la synthèse de l'ADNc.
• Cartographie haute résolution des terminaisons et des structures d'exon des transcrits d'ARN (communément appelée Berk-Sharp ou S1 Mapping) à l'aide de sondes marquées en interne ou en extrémité.
• Modification du site de restriction ou élimination par digestion des extrémités saillantes monocaténaires.
• Clivage des mésappariements d'une seule paire de bases, en remplacement de CEL 1 Nuclease dans TILLING.
• Délétion unidirectionnelle de gros ADN (en combinaison avec l'exonucléase III) pour générer des délétions ordonnées pour le séquençage.
• Suppression des extensions 3´ et 5´ des terminaisons ADN ou ARN.
• Cartographie transcriptionnelle.
• Décolleté des boucles en épingle à cheveux.
• Excision de séquences codant pour le gène de l'ADN génomique.

Les références

Lectures complémentaires

• Série de nombreux articles de Kowalski et al dans les années 1970: Kowalski, David; Kroeker, Warren D .; Laskowski, M. (1976). "Nucléase de haricot mungo I. 6. Propriétés physiques, chimiques et catalytiques". Biochimie . 15 (20): 4457–4463. doi : 10.1021 / bi00665a019 . PMID  9973 .