FDS-PAGE - SDS-PAGE
SDS-PAGE ( électrophorèse sur gel de dodécyl sulfate de sodium-polyacrylamide ), est un système électrophorétique discontinu développé par Ulrich K. Laemmli qui est couramment utilisé comme méthode pour séparer les protéines avec des masses moléculaires comprises entre 5 et 250 kDa . L'utilisation combinée de dodécylsulfate de sodium (SDS, également connu sous le nom de laurylsulfate de sodium) et de gel de polyacrylamide permet d'éliminer l'influence de la structure et de la charge, et les protéines sont séparées uniquement sur la base des différences de poids moléculaire.
Propriétés
SDS-PAGE est une méthode d' électrophorèse qui permet la séparation des protéines en masse. Le milieu (appelé aussi « matrice ») est un gel discontinu à base de polyacrylamide. Le gel de polyacrylamide est typiquement pris en sandwich entre deux plaques de verre dans une plaque de gel . Bien que les gels en tube (dans des cylindres de verre) aient été utilisés historiquement, ils sont rapidement devenus obsolètes avec l'invention des gels en plaque plus pratiques. De plus, le SDS ( dodécyl sulfate de sodium ) est utilisé. Environ 1,4 gramme de SDS se lie à un gramme de protéine, ce qui correspond à une molécule de SDS pour deux acides aminés . Le SDS agit comme un tensioactif , masquant la charge intrinsèque des protéines et leur conférant des rapports charge/masse très similaires. Les charges intrinsèques des protéines sont négligeables par rapport à la charge SDS, et les charges positives sont également fortement réduites dans la gamme de pH basique d'un gel de séparation. Lors de l'application d'un champ électrique constant, la protéine migre vers l'anode, chacune avec une vitesse différente, en fonction de sa masse. Cette procédure simple permet une séparation précise des protéines par masse.
Le SDS a tendance à former des micelles sphériques dans des solutions aqueuses au-dessus d'une certaine concentration appelée concentration micellaire critique (CMC). Au-dessus de la concentration micellaire critique de 7 à 10 millimolaires dans les solutions, le SDS se présente simultanément sous forme de molécules uniques ( monomère ) et sous forme de micelles, en dessous de la CMC, le SDS se présente uniquement sous forme de monomères dans des solutions aqueuses. A la concentration micellaire critique, une micelle est constituée d'environ 62 molécules de SDS. Cependant, seuls les monomères SDS se lient aux protéines via des interactions hydrophobes, alors que les micelles SDS sont anioniques à l'extérieur et n'adsorbent aucune protéine. Le SDS est de nature amphipathique, ce qui lui permet de déployer à la fois des sections polaires et non polaires de la structure des protéines. À des concentrations de SDS supérieures à 0,1 millimolaire, le dépliement des protéines commence, et au-dessus de 1 mM, la plupart des protéines sont dénaturées. En raison du fort effet dénaturant du SDS et de la dissociation ultérieure des complexes protéiques, les structures quaternaires ne peuvent généralement pas être déterminées avec le SDS. Les exceptions sont les protéines qui sont stabilisées par réticulation covalente, par exemple les liaisons -SS- et les complexes protéiques résistants au SDS, qui sont stables même en présence de SDS (ce dernier, cependant, uniquement à température ambiante). Pour dénaturer les complexes résistants au SDS, une énergie d'activation élevée est requise, qui est obtenue par chauffage. La résistance au SDS est basée sur une métastabilité du repli protéique. Bien que la protéine native, entièrement repliée, résistante au SDS n'ait pas une stabilité suffisante en présence de SDS, l' équilibre chimique de la dénaturation à température ambiante se produit lentement. Les complexes protéiques stables sont caractérisés non seulement par la résistance au SDS mais aussi par la stabilité contre les protéases et une demi-vie biologique accrue .
Alternativement, l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide peut également être réalisée avec les tensioactifs cationiques CTAB dans une CTAB-PAGE, ou 16-BAC dans une BAC-PAGE.
Procédure
La méthode SDS-PAGE est composée d'une préparation de gel, d'une préparation d'échantillon, d'une électrophorèse, d'une coloration des protéines ou d'un transfert western et d'une analyse du motif de bandes généré.
Production de gel
Lors de l'utilisation de différents tampons dans le gel (électrophorèse sur gel discontinu), les gels sont constitués jusqu'à un jour avant l'électrophorèse, afin que la diffusion ne conduise pas à un mélange des tampons. Le gel est produit par polymérisation radicalaire dans un moule constitué de deux plaques de verre scellées avec des espaceurs entre les plaques de verre. Dans une configuration typique de mini-gel, les espaceurs ont une épaisseur de 0,75 mm ou 1,5 mm, ce qui détermine la capacité de charge du gel. Pour verser la solution de gel, les plaques sont généralement fixées dans un support qui scelle temporairement la face inférieure autrement ouverte des plaques de verre avec les deux espaceurs. Pour la solution de gel, l'acrylamide est mélangé comme gel-former (généralement 4% V/V dans le gel d'empilement et 10-12% dans le gel de séparation), le méthylènebisacrylamide comme agent de réticulation, tampon de gel d'empilement ou de séparation, eau et SDS . En ajoutant le catalyseur TEMED et l'initiateur radicalaire persulfate d'ammonium (APS) la polymérisation est démarrée. La solution est ensuite versée entre les plaques de verre sans créer de bulles. Selon la quantité de catalyseur et de starter radicalaire et selon la température, la polymérisation dure entre un quart d'heure et plusieurs heures. Le gel inférieur (gel de séparation) est d'abord versé et recouvert de quelques gouttes d'un alcool à peine soluble dans l'eau (généralement du butanol ou de l'isopropanol saturé de tampon), qui élimine les bulles du ménisque et protège la solution gélifiée de l' oxygénateur radicalaire . Après la polymérisation du gel de séparation, l'alcool est jeté et l'alcool résiduel est éliminé avec du papier filtre . Après addition d'APS et de TEMED à la solution de gel d'empilement, celle-ci est versée sur le gel de séparation solide. Ensuite, un peigne à échantillon approprié est inséré entre les plaques de verre sans créer de bulles. Le peigne à échantillon est soigneusement retiré après la polymérisation, laissant des poches pour l'application de l'échantillon. Pour une utilisation ultérieure des protéines pour le séquençage des protéines , les gels sont souvent préparés la veille de l'électrophorèse pour réduire les réactions de l'acrylamide non polymérisé avec les cystéines dans les protéines.
En utilisant un mélangeur à gradient, des gels à gradient avec un gradient d'acrylamide (généralement de 4 à 12%) peuvent être coulés, qui ont une plus grande plage de séparation des masses moléculaires. Les systèmes de gel commerciaux (appelés gels prémoulés ) utilisent généralement la substance tampon Bis-tris méthane avec un pH compris entre 6,4 et 7,2 à la fois dans le gel d'empilement et dans le gel de séparation. Ces gels sont livrés coulés et prêts à l'emploi. Comme ils n'utilisent qu'un seul tampon ( électrophorèse sur gel en continu ) et ont un pH presque neutre, ils peuvent être conservés plusieurs semaines. Le pH plus neutre ralentit l'hydrolyse et donc la décomposition du polyacrylamide. De plus, il y a moins de cystéines modifiées par l'acrylamide dans les protéines. En raison du pH constant du gel de collecte et de séparation, il n'y a pas d'effet d'empilement. Les protéines des gels BisTris ne peuvent pas être colorées avec des complexes de ruthénium. Ce système de gel a une plage de séparation relativement large, qui peut être modifiée en utilisant du MES ou du MOPS dans le tampon de fonctionnement.
La préparation des échantillons
Lors de la préparation de l'échantillon, le tampon de l'échantillon, et donc le SDS, est ajouté en excès aux protéines, et l'échantillon est ensuite chauffé à 95 °C pendant cinq minutes, ou bien à 70 °C pendant dix minutes. Le chauffage perturbe les structures secondaires et tertiaires de la protéine en perturbant les liaisons hydrogène et en étirant les molécules. Facultativement, les ponts disulfure peuvent être clivés par réduction. A cet effet, des thiols réducteurs tels que le β-mercaptoéthanol (β-ME, 5% en volume), le dithiothréitol (DTT, 10 millimolaires) ou le dithioérythritol (DTE, 10 millimolaires) sont ajoutés au tampon échantillon. Après refroidissement à température ambiante, chaque échantillon est pipeté dans son propre puits dans le gel, qui a été préalablement immergé dans du tampon d'électrophorèse dans l'appareil d'électrophorèse.
En plus des échantillons, un marqueur de taille de poids moléculaire est généralement chargé sur le gel. Celui-ci est constitué de protéines de tailles connues et permet ainsi d'estimer (avec une erreur de ± 10 %) les tailles des protéines dans les échantillons réels, qui migrent en parallèle dans différentes pistes du gel. Le marqueur de taille est souvent pipeté dans la première ou la dernière poche d'un gel.
Électrophorèse
Pour la séparation, les échantillons dénaturés sont chargés sur un gel de polyacrylamide, qui est placé dans un tampon d'électrophorèse avec des électrolytes appropriés. Par la suite, une tension (généralement autour de 100 V, 10-20 V par cm de longueur de gel) est appliquée, ce qui provoque une migration de molécules chargées négativement à travers le gel en direction de l' anode chargée positivement . Le gel agit comme un tamis. Les petites protéines migrent relativement facilement à travers la maille du gel, tandis que les protéines plus grosses sont plus susceptibles d'être retenues et migrent ainsi plus lentement à travers le gel, permettant ainsi aux protéines d'être séparées par taille moléculaire. L'électrophorèse dure entre une demi-heure à plusieurs heures selon la tension et la longueur du gel utilisé.
Les protéines qui migrent le plus rapidement (avec un poids moléculaire inférieur à 5 kDa) forment le front tampon avec les composants anioniques du tampon d'électrophorèse, qui migrent également à travers le gel. La zone du front du tampon est rendue visible en ajoutant le bleu de bromophénol , colorant anionique, relativement petit, au tampon de l'échantillon. En raison de la taille relativement petite des molécules du bleu de bromophénol, il migre plus rapidement que les protéines. Par contrôle optique de la bande colorée migrante, l'électrophorèse peut être arrêtée avant le colorant et aussi les échantillons ont complètement migré à travers le gel et le quittent.
La méthode la plus couramment utilisée est la SDS-PAGE discontinue. Dans cette méthode, les protéines migrent d'abord dans un gel collecteur à pH neutre, dans lequel elles sont concentrées, puis elles migrent dans un gel séparateur à pH basique, dans lequel a lieu la séparation proprement dite. Les gels d'empilage et de séparation diffèrent par la taille des pores (4-6 % T et 10-20 % T), la force ionique et les valeurs de pH (pH 6,8 ou pH 8,8). L'électrolyte le plus fréquemment utilisé est un système tampon Tris - glycine - chlorure contenant du SDS . A pH neutre, la glycine forme majoritairement la forme zwitterionique , à pH élevé les glycines perdent des charges positives et deviennent majoritairement anioniques. Dans le gel de collecte, les ions chlorure plus petits et chargés négativement migrent devant les protéines (comme ions de tête) et les ions glycinate légèrement plus gros, chargés négativement et partiellement positivement migrent derrière les protéines (comme ions de queue initiaux), tandis que dans le gel de collecte, gel de séparation basique les deux ions migrent devant les protéines. Le gradient de pH entre les tampons de gel d'empilement et de séparation conduit à un effet d'empilement à la frontière du gel d'empilement jusqu'au gel de séparation, car le glycinate perd partiellement ses charges positives ralentissantes à mesure que le pH augmente, puis, à mesure que l'ancien ion arrière, dépasse les protéines et devient un ion de tête, ce qui fait que les bandes des différentes protéines (visibles après une coloration) deviennent plus étroites et plus nettes - l'effet d'empilement. Pour la séparation de protéines et de peptides plus petits, le système tampon TRIS- Tricine de Schägger et von Jagow est utilisé en raison de la plus grande dispersion des protéines dans la plage de 0,5 à 50 kDa.
Coloration en gel
À la fin de la séparation électrophorétique, toutes les protéines sont triées par taille et peuvent ensuite être analysées par d'autres méthodes, par exemple la coloration des protéines telle que la coloration de Coomassie (la plus courante et la plus facile à utiliser), la coloration à l'argent (la plus haute sensibilité), colore toutes les colorations, amido 10B noir coloration, FCF vert coloration, les taches fluorescentes telles que epicocconone tache et tache SYPRO orange, et la détection immunologique telles que le Western Blot . Les colorants fluorescents ont une linéarité comparativement plus élevée entre la quantité de protéine et l'intensité de la couleur d'environ trois ordres de grandeur au-dessus de la limite de détection , c'est-à-dire que la quantité de protéine peut être estimée par l'intensité de la couleur. Lors de l'utilisation du colorant protéique fluorescent trichloroéthanol , une coloration ultérieure de la protéine est omise si elle a été ajoutée à la solution de gel et que le gel a été irradié avec de la lumière UV après électrophorèse.
Dans la coloration de Coomassie , le gel est fixé dans une solution d'acide acétique glacial à 50 % d'éthanol à 10 % pendant 1 heure. Ensuite, la solution est changée pour une fraîche et après 1 à 12 heures, le gel est changé en une solution de coloration (50% de méthanol, 10% d'acide acétique glacial, 0,1% de bleu brillant de coomassie) suivie d'une décoloration en changeant plusieurs fois une solution de décoloration de 40%. méthanol, 10 % d'acide acétique glacial.
Une analyse
La coloration des protéines dans le gel crée un motif de bandes documentable des différentes protéines. Les glycoprotéines ont des niveaux différentiels de glycosylations et adsorbent le SDS de manière plus inégale au niveau des glycosylations, ce qui entraîne des bandes plus larges et floues. Les protéines membranaires , en raison de leur domaine transmembranaire , sont souvent composées des acides aminés les plus hydrophobes, ont une solubilité plus faible dans les solutions aqueuses, ont tendance à se lier aux lipides et ont tendance à précipiter dans les solutions aqueuses en raison d' effets hydrophobes lorsque des quantités suffisantes de détergent ne sont pas présentes. . Cette précipitation se manifeste pour les protéines membranaires dans une SDS-PAGE en "suivant" au-dessus de la bande de la protéine transmembranaire. Dans ce cas, plus de SDS peut être utilisé (en utilisant un tampon d'échantillon plus ou plus concentré) et la quantité de protéines dans l'application d'échantillon peut être réduite. Une surcharge du gel avec une protéine soluble crée une bande semi-circulaire de cette protéine (par exemple dans la bande de marquage de l'image à 66 kDa), permettant de couvrir d'autres protéines de poids moléculaires similaires. Un faible contraste (comme dans la bande de marquage de l'image) entre les bandes au sein d'une bande indique soit la présence de nombreuses protéines (faible pureté) ou, si vous utilisez des protéines purifiées et qu'un faible contraste ne se produit qu'en dessous d'une bande, cela indique une dégradation protéolytique de la protéine, ce qui provoque d'abord des bandes de dégradation, et après une dégradation supplémentaire produit une couleur homogène (« frottis ») en dessous d'une bande. La documentation du motif de bandes se fait généralement par photographie ou par numérisation. Pour une récupération ultérieure des molécules en bandes individuelles, une extraction sur gel peut être effectuée.
Archivage
Après coloration des protéines et documentation du motif de bandes, le gel de polyacrylamide peut être séché pour le stockage d'archives. Des protéines peuvent en être extraites à une date ultérieure. Le gel est soit placé dans un cadre de séchage (avec ou sans utilisation de chaleur) soit dans un séchoir sous vide. Le cadre de séchage se compose de deux parties, dont l'une sert de base à un film cellophane humide auquel sont ajoutés le gel et une solution à 1% de glycérol . Ensuite, un deuxième film cellophane humide est appliqué sans bulles, la deuxième partie du cadre est posée sur le dessus et le cadre est scellé avec des clips. L'élimination des bulles d'air évite une fragmentation du gel lors du séchage. L'eau s'évapore à travers le film cellophane. Contrairement au châssis de séchage, un sécheur sous vide génère un vide et chauffe le gel à environ 50 °C.
Détermination de la masse moléculaire
Pour une détermination plus précise du poids moléculaire, les distances de migration relatives des bandes de protéines individuelles sont mesurées dans le gel de séparation. Les mesures sont généralement effectuées en triple pour une précision accrue. La mobilité relative (appelée valeur Rf ou valeur Rm) est le quotient de la distance de la bande de la protéine et de la distance du front tampon. Les distances des bandes et du front tampon sont mesurées chacune depuis le début du gel de séparation. La distance du front du tampon correspond approximativement à la distance du bleu de bromophénol contenu dans le tampon échantillon. Les distances relatives des protéines du marqueur de taille sont tracées de manière semi-logarithmique par rapport à leurs poids moléculaires connus. Par comparaison avec la partie linéaire du graphique généré ou par une analyse de régression, le poids moléculaire d'une protéine inconnue peut être déterminé par sa mobilité relative. Les bandes de protéines avec des glycosylations peuvent être floues. Les protéines avec de nombreux acides aminés basiques (par exemple les histones ) peuvent conduire à une surestimation du poids moléculaire ou même ne pas migrer du tout dans le gel, car elles se déplacent plus lentement dans l'électrophorèse en raison des charges positives ou même dans la direction opposée. En conséquence, de nombreux acides aminés acides peuvent conduire à une migration accélérée d'une protéine et à une sous-estimation de sa masse moléculaire.
Applications
Le SDS-PAGE en combinaison avec un colorant protéique est largement utilisé en biochimie pour la séparation rapide et exacte et l'analyse ultérieure des protéines. Il a des coûts d'instruments et de réactifs comparativement bas et est une méthode facile à utiliser. En raison de sa faible évolutivité , il est principalement utilisé à des fins analytiques et moins à des fins de préparation, en particulier lorsque de plus grandes quantités d'une protéine doivent être isolées.
De plus, SDS-PAGE est utilisé en combinaison avec le western blot pour la détermination de la présence d'une protéine spécifique dans un mélange de protéines - ou pour l'analyse de modifications post-traductionnelles . Des modifications post-traductionnelles des protéines peuvent conduire à une mobilité relative différente (ie un décalage de bande ) ou à une modification de la liaison d'un anticorps de détection utilisé dans le western blot (ie une bande disparaît ou apparaît).
En spectrométrie de masse des protéines, SDS-PAGE est une méthode largement utilisée pour la préparation d'échantillons avant la spectrométrie, principalement en utilisant la digestion en gel . En ce qui concerne la détermination de la masse moléculaire d'une protéine, la SDS-PAGE est un peu plus précise qu'une ultracentrifugation analytique , mais moins exacte qu'une spectrométrie de masse ou - en ignorant les modifications post-traductionnelles - un calcul de la masse moléculaire de la protéine à partir de l' ADN séquence .
En diagnostic médical, la SDS-PAGE est utilisée dans le cadre du test VIH et pour évaluer la protéinurie . Dans le test VIH, les protéines VIH sont séparées par SDS-PAGE puis détectées par Western Blot avec les anticorps spécifiques du VIH du patient, si elles sont présentes dans son sérum sanguin . La SDS-PAGE pour la protéinurie évalue les taux de diverses protéines sériques dans l'urine, par exemple l' albumine , l' alpha-2-macroglobuline et les IgG .
Variantes
SDS-PAGE est la méthode la plus largement utilisée pour la séparation électrophorétique sur gel des protéines. L'électrophorèse sur gel bidimensionnelle combine séquentiellement la focalisation isoélectrique ou BAC-PAGE avec une SDS-PAGE. La PAGE native est utilisée si le repliement de la protéine native doit être maintenu. Pour la séparation des protéines membranaires, BAC-PAGE ou CTAB-PAGE peuvent être utilisés comme alternative à SDS-PAGE. Pour la séparation électrophorétique de complexes protéiques plus gros, l' électrophorèse sur gel d'agarose peut être utilisée, par exemple le SDD-AGE . Certaines enzymes peuvent être détectées via leur activité enzymatique par zymographie .
Alternatives
Tout en étant l'une des méthodes de séparation et d'analyse des protéines les plus précises et les plus économiques, la SDS-PAGE dénature les protéines. Lorsque des conditions non dénaturantes sont nécessaires, les protéines sont séparées par une PAGE native ou différentes méthodes chromatographiques avec quantification photométrique ultérieure , par exemple la chromatographie d'affinité (ou même la purification par affinité en tandem ), la chromatographie d'exclusion stérique , la chromatographie d'échange d'ions . Les protéines peuvent également être séparées par taille dans une filtration à flux tangentiel ou une ultrafiltration . Les protéines individuelles peuvent être isolées d'un mélange par chromatographie d'affinité ou par un essai pull-down . Certaines méthodes de séparation historiquement précoces et rentables mais brutes reposent généralement sur une série d' extractions et de précipitations utilisant des molécules kosmotropes , par exemple la précipitation au sulfate d'ammonium et la précipitation au polyéthylèneglycol .
Histoire
En 1948, Arne Tiselius a reçu le prix Nobel de chimie pour la découverte du principe de l'électrophorèse comme la migration d'atomes ou de molécules chargés et dissous dans un champ électrique. L'utilisation d'une matrice solide (initialement des disques de papier) dans une électrophorèse de zone a amélioré la séparation. L'électrophorèse discontinue de 1964 par L. Ornstein et BJ Davis a permis d'améliorer la séparation par effet d'empilement. L'utilisation d'hydrogels de polyacrylamide réticulé, contrairement aux disques de papier ou aux gels d'amidon précédemment utilisés, a fourni une plus grande stabilité du gel et aucune décomposition microbienne. L'effet dénaturant du SDS dans les gels continus de polyacrylamide et l'amélioration de la résolution qui en résulte ont été décrits pour la première fois en 1965 par David F. Summers dans le groupe de travail de James E. Darnell pour séparer les protéines du poliovirus. La variante actuelle de la SDS-PAGE a été décrite en 1970 par Ulrich K. Laemmli et initialement utilisée pour caractériser les protéines de la tête du bactériophage T4 . Cet article de Laemmli est largement cité pour l'invention du SDS-PAGE moderne, mais la technique a en fait été inventée par Jake Maizel, qui effectuait un congé sabbatique dans le laboratoire du MRC lorsque Laemmli a rejoint le laboratoire en tant que stagiaire postdoctoral. Maizel a partagé sa technologie antérieure avec Laemmli et ensemble, ils ont apporté de nouvelles améliorations. Laemmli et Maizel avaient prévu de poursuivre avec un article sur les méthodes, mais cela ne s'est jamais concrétisé. Maizel retrace l'histoire du développement de SDS-PAGE en bref commentaire.
Les références
Liens externes
- Protocole pour BisTris SDS-PAGE sur OpenWetWare.org