Séquençage des nanopores - Nanopore sequencing

Sur la gauche est un dessin du complexe formé entre l' alpha-hémolysine et l' ADNdb avec liaison par un oligomère . A droite, le mouvement de ce complexe par rapport à un canal nanopore est montré séquentiellement en deux étapes (I) et (II). Une fois le complexe inséré dans le nanopore, la protéine alpha-hémolysine sera fonctionnelle dans le système nanopore hybride, biologique et solide nouvellement formé.

Illustration de la façon dont un signal électrique est généré à partir de l'ADN passant à travers un canal nanopore.

Le séquençage des nanopores est une approche de troisième génération utilisée dans le séquençage des biopolymères , en particulier des polynucléotides sous forme d' ADN ou d' ARN .

En utilisant le séquençage nanopore, une seule molécule d'ADN ou d'ARN peut être séquencée sans avoir besoin d'une amplification PCR ou d'un marquage chimique de l'échantillon. Au moins une de ces étapes susmentionnées est nécessaire dans la procédure de toute approche de séquençage précédemment développée. Le séquençage Nanopore a le potentiel d'offrir un génotypage relativement peu coûteux , une grande mobilité pour les tests et un traitement rapide des échantillons avec la possibilité d'afficher les résultats en temps réel. Les publications sur la méthode décrivent son utilisation dans l'identification rapide d'agents pathogènes viraux, la surveillance d' Ebola , la surveillance environnementale, la surveillance de la sécurité alimentaire, le séquençage du génome humain, le séquençage du génome végétal, la surveillance de la résistance aux antibiotiques , l'haplotypage et d'autres applications.

Développement

Le séquençage des nanopores a pris 25 ans pour se matérialiser pleinement. Il impliquait une étroite collaboration entre les universités et l'industrie. L'une des premières personnes à proposer l'idée du séquençage des nanopores a été le professeur David Deamer . En 1989, il a esquissé un plan pour conduire un simple brin d'ADN à travers un nanopore de protéine intégré dans une fine membrane dans le cadre de son travail pour synthétiser l'ARN à partir de zéro. Réalisant que la même approche pourrait potentiellement améliorer le séquençage de l'ADN, Deamer et son équipe ont passé la décennie suivante à la tester. En 1999, Deamer et ses collègues ont publié le premier article utilisant le terme « séquençage de nanopores » et deux ans plus tard, ils ont produit une image capturant une épingle à cheveux d'ADN passant à travers un nanopore en temps réel. Une autre base pour le séquençage des nanopores a été jetée par les travaux d'une équipe dirigée par le professeur Hagan Bayley qui, à partir des années 1990, a commencé à développer indépendamment la détection stochastique, une technique qui mesure le changement d'un courant ionique traversant un nanopore pour déterminer la concentration et l'identité de une substance. En 2005, Bayley avait fait des progrès substantiels avec la méthode de séquençage de l'ADN et a cofondé Oxford Nanopore pour aider à pousser la technologie plus loin. En 2014, la société a lancé son premier appareil de séquençage portable à nanopores. Cela a permis d'effectuer le séquençage de l'ADN presque partout, même dans des zones reculées aux ressources limitées. Il a été utilisé pendant la pandémie de COVID-19. Un quart de tous les génomes du virus SARS-Cov2 dans le monde ont maintenant été séquencés avec des dispositifs à nanopores. La technologie offre également un outil important pour lutter contre la résistance aux antimicrobiens, une menace de plus en plus importante pour la santé publique.

Principes de détection

La membrane biologique ou à l'état solide, où se trouve le nanopore , est entourée d'une solution d'électrolyte. La membrane divise la solution en deux chambres. Une tension de polarisation est appliquée à travers la membrane induisant un champ électrique qui met en mouvement des particules chargées, dans ce cas les ions. Cet effet est connu sous le nom d' électrophorèse . Pour des concentrations suffisamment élevées, la solution d'électrolyte est bien répartie et toute la chute de tension se concentre à proximité et à l'intérieur du nanopore. Cela signifie que les particules chargées dans la solution ne ressentent une force du champ électrique que lorsqu'elles sont près de la région des pores. Cette région est souvent appelée région de capture. À l'intérieur de la région de capture, les ions ont un mouvement dirigé qui peut être enregistré comme un courant ionique constant en plaçant des électrodes près de la membrane. Imaginez maintenant un polymère nanométrique tel que de l'ADN ou une protéine placé dans l'une des chambres. Cette molécule a également une charge nette qui ressent une force du champ électrique lorsqu'elle se trouve dans la région de capture. La molécule s'approche de cette région de capture aidée par le mouvement brownien et toute attraction qu'elle pourrait avoir à la surface de la membrane. Une fois à l'intérieur du nanopore, la molécule se déplace via une combinaison de forces électrophorétiques, électro-osmotiques et parfois thermophorétiques. A l'intérieur du pore, la molécule occupe un volume qui restreint partiellement le flux d'ions, observé comme une chute de courant ionique. Sur la base de divers facteurs tels que la géométrie, la taille et la composition chimique, le changement d'amplitude du courant ionique et la durée de la translocation varieront. Différentes molécules peuvent alors être détectées et potentiellement identifiées sur la base de cette modulation du courant ionique.

Identification de la base

L'amplitude de la densité de courant électrique à travers une surface de nanopore dépend des dimensions du nanopore et de la composition de l'ADN ou de l'ARN qui occupe le nanopore. Le séquençage a été rendu possible car, en passant par le canal du nanopore, les échantillons provoquent des changements caractéristiques de la densité du courant électrique circulant à travers le nanopore. La charge totale circulant à travers un canal de nanopores est égale à l'intégrale de surface du flux de densité de courant électrique à travers les surfaces normales des unités de nanopores entre les instants t ₁ et t ₂ .

Les types

Biologique

pore d'alpha-hémolysine (constitué de 7 sous-unités identiques de 7 couleurs) et d'ADN simple brin 12-mer (en blanc) à la même échelle pour illustrer les effets de l'ADN sur la conductance lors du déplacement à travers un nanopore. Ci-dessous, une vue orthogonale des mêmes molécules.

Le séquençage biologique des nanopores repose sur l'utilisation de protéines transmembranaires, appelées porines , qui sont intégrées dans les membranes lipidiques afin de créer des surfaces poreuses dépendantes de la taille - avec des "trous" à l'échelle nanométrique répartis à travers les membranes. Une vitesse de translocation suffisamment faible peut être atteinte grâce à l'incorporation de diverses protéines qui facilitent le mouvement de l'ADN ou de l'ARN à travers les pores des membranes lipidiques.

Alpha hémolysine

L'alpha hémolysine (αHL), un nanopore de bactérie responsable de la lyse des globules rouges, est étudiée depuis plus de 15 ans. À ce stade, des études ont montré que les quatre bases peuvent être identifiées en utilisant le courant ionique mesuré à travers le pore αHL. La structure de αHL est avantageuse pour identifier des bases spécifiques se déplaçant à travers le pore. Le pore αHL mesure environ 10 nm de long, avec deux sections distinctes de 5 nm. La section supérieure se compose d'une structure plus grande ressemblant à un vestibule et la section inférieure se compose de trois sites de reconnaissance possibles (R1, R2, R3) et est capable de discriminer entre chaque base.

Le séquençage utilisant αHL a été développé à partir d'études fondamentales et de mutations structurelles, s'orientant vers le séquençage de lectures très longues. La mutation protéique de αHL a amélioré les capacités de détection du pore. La prochaine étape proposée consiste à lier une exonucléase sur le pore αHL. L'enzyme cliverait périodiquement des bases uniques, permettant au pore d'identifier les bases successives. Le couplage d'une exonucléase au pore biologique ralentirait la translocation de l'ADN à travers le pore et augmenterait la précision de l'acquisition des données.

Notamment, les théoriciens ont montré que le séquençage via des enzymes exonucléases tel que décrit ici n'est pas réalisable. Ceci est principalement dû aux effets liés à la diffusion imposant une limite à la probabilité de capture de chaque nucléotide lorsqu'il est clivé. Il en résulte une probabilité significative qu'un nucléotide ne soit pas capturé avant sa diffusion dans la masse ou capturé dans le désordre, et ne soit donc pas correctement séquencé par le nanopore, ce qui entraîne des erreurs d'insertion et de suppression. Par conséquent, des changements majeurs sont nécessaires à cette méthode avant qu'elle puisse être considérée comme une stratégie viable.

Une étude récente a mis en évidence la capacité de αHL à détecter des nucléotides sur deux sites distincts dans la moitié inférieure du pore. Les sites R1 et R2 permettent à chaque base d'être surveillée deux fois lorsqu'elle se déplace dans le pore, créant 16 valeurs de courant ionique mesurables différentes au lieu de 4. Cette méthode améliore la lecture unique à travers le nanopore en doublant les sites sur lesquels la séquence est lue par nanopore.

MspA

Mycobacterium smegmatis porine A (MspA) est le deuxième nanopore biologique actuellement à l'étude pour le séquençage de l'ADN. Le pore MspA a été identifié comme une amélioration potentielle par rapport à αHL en raison d'une structure plus favorable. Le pore est décrit comme un gobelet avec un rebord épais et un diamètre de 1,2 nm au fond du pore. Un MspA naturel, bien que favorable pour le séquençage de l'ADN en raison de sa forme et de son diamètre, a un noyau négatif qui interdit la translocation d'ADN simple brin (ADNsb). Le nanopore naturel a été modifié pour améliorer la translocation en remplaçant trois acides aspartiques chargés négativement par des asparagines neutres.

La détection par courant électrique des nucléotides à travers la membrane s'est avérée dix fois plus spécifique que αHL pour l'identification des bases. En utilisant cette spécificité améliorée, un groupe de l'Université de Washington a proposé d'utiliser un ADN double brin (ADNdb) entre chaque molécule simple brin pour maintenir la base dans la section de lecture du pore. L'ADNdb arrêterait la base dans la section correcte du pore et permettrait l'identification du nucléotide. Une subvention récente a été attribuée à une collaboration de l'UC Santa Cruz, de l'Université de Washington et de l'Université Northeastern pour améliorer la reconnaissance de base de MspA en utilisant la polymérase phi29 en conjonction avec le pore.

État solide

Les approches de séquençage des nanopores à l'état solide, contrairement au séquençage biologique des nanopores, n'incorporent pas de protéines dans leurs systèmes. Au lieu de cela, la technologie des nanopores à l'état solide utilise divers substrats en métal ou en alliage métallique avec des pores de taille nanométrique qui permettent à l'ADN ou à l'ARN de passer à travers. Ces substrats jouent le plus souvent un rôle intégral dans la reconnaissance de séquences d'acides nucléiques lors de leur translocation à travers les canaux le long des substrats.

Courant tunnel

Figure montrant le mouvement théorique de l'ADNsb à travers un système de nanopores à effet tunnel. La détection est rendue possible par l'incorporation d'électrodes le long des parois des canaux nanopores perpendiculaires au vecteur vitesse de l'ADNsb.

La mesure de l'effet tunnel d'électrons à travers les bases lors de la translocation de l'ADNsb à travers le nanopore est une méthode améliorée de séquençage des nanopores à l'état solide. La plupart des recherches se sont concentrées sur la preuve que les bases pouvaient être déterminées à l'aide de l'effet tunnel électronique. Ces études ont été menées en utilisant un microscope à sonde à balayage comme électrode de détection et ont prouvé que les bases peuvent être identifiées par des courants tunnel spécifiques. Après la recherche de la preuve de principe, un système fonctionnel doit être créé pour coupler les pores à l'état solide et les dispositifs de détection.

Des chercheurs du groupe Harvard Nanopore ont conçu des pores à l'état solide avec des nanotubes de carbone à paroi unique sur tout le diamètre du pore. Des réseaux de pores sont créés et un dépôt chimique en phase vapeur est utilisé pour créer des nanotubes qui se développent à travers le réseau. Une fois qu'un nanotube s'est développé à travers un pore, le diamètre du pore est ajusté à la taille souhaitée. La création réussie d'un nanotube couplé à un pore est une étape importante vers l'identification des bases lors de la translocation de l'ADNsb à travers le pore à l'état solide.

Une autre méthode est l'utilisation de nanoélectrodes de part et d'autre d'un pore. Les électrodes sont spécifiquement créées pour permettre la formation d'un nanopore à l'état solide entre les deux électrodes. Cette technologie pourrait être utilisée non seulement pour détecter les bases, mais aussi pour aider à contrôler la vitesse et l'orientation de la translocation des bases.

Fluorescence

Une technique efficace pour déterminer une séquence d'ADN a été développée en utilisant des nanopores à l'état solide et la fluorescence . Cette méthode de séquençage par fluorescence convertit chaque base en une représentation caractéristique de plusieurs nucléotides qui se lient à un ADNdb formant une sonde fluorescente. Avec le système bicolore proposé, chaque base est identifiée par deux fluorescences distinctes, et sera donc convertie en deux séquences spécifiques. Les sondes se composent d'un fluorophore et d'un extincteur au début et à la fin de chaque séquence, respectivement. Chaque fluorophore sera éteint par le quencher à la fin de la séquence précédente. Lorsque l'ADNdb effectue une translocation à travers un nanopore à l'état solide, le brin de sonde sera retiré et le fluorophore en amont sera fluorescent.

Cette méthode de séquençage a une capacité de 50 à 250 bases par seconde par pore, et un système de fluorophore à quatre couleurs (chaque base pourrait être convertie en une séquence au lieu de deux), séquencera plus de 500 bases par seconde. Les avantages de cette méthode reposent sur la lecture claire du séquençage, à l'aide d'une caméra au lieu de méthodes de courant bruyant. Cependant, la méthode nécessite une préparation d'échantillon pour convertir chaque base en un code binaire étendu avant le séquençage. Au lieu d'identifier une base lors de sa translocation à travers le pore, environ 12 bases sont nécessaires pour trouver la séquence d'une base.

Comparaison entre les types

Contraintes majeures

1. Faible vitesse de translocation : vitesse à laquelle un échantillon passe à travers les pores d'une unité suffisamment lentement pour être mesuré
2. Reproductibilité dimensionnelle : la probabilité que le pore d'une unité ait la bonne taille
3. Tolérance au stress : la sensibilité d'une unité aux conditions environnementales internes
4. Longévité : la durée pendant laquelle une unité est censée continuer à fonctionner
5. Facilité de fabrication : la capacité de produire une unité - généralement en ce qui concerne la production en série

Biologique : avantages et inconvénients

Les systèmes de séquençage de nanopores biologiques ont plusieurs caractéristiques fondamentales qui les rendent avantageux par rapport aux systèmes à l'état solide, chaque caractéristique avantageuse de cette approche de conception résultant de l'incorporation de protéines dans leur technologie. La structure uniforme des pores, le contrôle précis de la translocation des échantillons à travers les canaux des pores et même la détection de nucléotides individuels dans les échantillons peuvent être facilités par des protéines uniques provenant de divers types d'organismes.

L'utilisation de protéines dans les systèmes de séquençage biologique des nanopores, malgré les divers avantages, apporte également certaines caractéristiques négatives. La sensibilité des protéines de ces systèmes au stress environnemental local a un impact important sur la longévité des unités, dans l'ensemble. Un exemple est qu'une protéine motrice ne peut décompresser des échantillons qu'à une vitesse suffisante dans une certaine plage de pH tout en ne fonctionnant pas assez rapidement en dehors de la plage - cette contrainte a un impact sur la fonctionnalité de l'ensemble de l'unité de séquençage. Un autre exemple est qu'une porine transmembranaire ne peut fonctionner de manière fiable que pendant un certain nombre de cycles avant de se décomposer. Ces deux exemples devraient être contrôlés dans la conception de tout système de nanopores biologiques viables, ce qui peut être difficile à réaliser tout en maintenant les coûts d'une telle technologie aussi bas et aussi compétitifs que possible par rapport aux autres systèmes.

Défis

Un défi pour la méthode de « séquençage de brin » consistait à affiner la méthode pour améliorer sa résolution afin de pouvoir détecter des bases uniques. Dans les premières méthodes des articles, un nucléotide devait être répété dans une séquence environ 100 fois successivement afin de produire un changement caractéristique mesurable. Cette faible résolution est due au fait que le brin d'ADN se déplace rapidement à une vitesse de 1 à 5 µs par base à travers le nanopore. Cela rend l'enregistrement difficile et sujet au bruit de fond, ce qui ne permet pas d'obtenir une résolution d'un seul nucléotide. Le problème est résolu soit en améliorant la technologie d'enregistrement, soit en contrôlant la vitesse du brin d'ADN par diverses stratégies d'ingénierie des protéines et Oxford Nanopore utilise une « approche kmer », analysant plus d'une base à la fois afin que des segments d'ADN soient soumis répéter l'interrogation pendant que le brin se déplace à travers le nanopore une base à la fois. Diverses techniques, notamment algorithmiques, ont été utilisées pour améliorer les performances de la technologie MinION depuis sa première mise à disposition des utilisateurs. Plus récemment, des effets de bases simples dus à une structure secondaire ou à des mononucléotides libérés ont été montrés.

Le professeur Hagan Bayley a proposé en 2010 que la création de deux sites de reconnaissance dans un pore d' alpha-hémolysine pourrait conférer des avantages dans la reconnaissance des bases.

L'un des défis de l'« approche exonucléase », où une enzyme processive alimente des bases individuelles, dans le bon ordre, dans le nanopore, consiste à intégrer les systèmes de détection d'exonucléase et de nanopore. En particulier, le problème est que lorsqu'une exonucléase hydrolyse les liaisons phosphodiester entre les nucléotides de l'ADN, il n'est pas nécessairement garanti que le nucléotide libéré par la suite se déplace directement, par exemple, dans un nanopore d'alpha-hémolysine voisin . Une idée consiste à attacher l'exonucléase au nanopore, peut-être par biotinylation à l' hémolysine bêta-baril . Le pore central de la protéine peut être tapissé de résidus chargés disposés de sorte que les charges positives et négatives apparaissent sur les côtés opposés du pore. Cependant, ce mécanisme est principalement discriminatoire et ne constitue pas un mécanisme pour guider les nucléotides sur un chemin particulier.

Les références

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