Culture ovarienne - Ovarian culture
La culture ovarienne est un processus in vitro qui permet d'étudier le développement, la toxicologie et la pathologie de l' ovaire . Cette technique peut également être utilisée pour étudier les applications possibles des traitements de fertilité, par exemple l'isolement d'ovocytes à partir de follicules ovariens primordiaux qui pourraient être utilisés pour la fécondation.
Méthodes de culture utilisant du tissu ovarien de souris
Il existe plusieurs systèmes de culture qui peuvent être utilisés pour étudier la croissance et le développement ovariens et folliculaires.
Culture ovarienne entière
La culture d'ovaires intacts favorise la formation et le développement des follicules primordiaux. Les ovaires sont disséqués à partir de souriceaux néonatals et placés dans un milieu de culture ovarienne contenant de l' albumine de sérum bovin (BSA) dissous dans du milieu essentiel -Minimal (αMEM). Les cultures sont maintenues dans un incubateur 37℃, 5% CO 2 puis les ovaires sont congelés ou fixés pour faciliter la poursuite des études.
Culture folliculaire
Individuel
Cette méthode de culture soutient la croissance des follicules individuels du stade pré-antral tardif au stade pré-ovulatoire. Ce système permet d'étudier la croissance folliculaire et la production d'hormones. Les ovaires des jeunes souris (19 à 23 jours) sont prélevés et coupés en deux, et les follicules sont identifiés au microscope. Les follicules pré-antraux tardifs sont identifiés comme ayant un diamètre de 180-200 µm et contenant 2-3 couches de cellules de la granulosa . Les follicules sont disséqués manuellement puis examinés pour leur aptitude à la culture. Les follicules ne sont choisis pour la culture que s'ils sont sains (diamètre de 190 ± 10 µm ; translucides ; sans zones atrétiques sombres ; lame basale intacte .) Puits contenant du milieu de culture folliculaire (α-Minimal Essential Media, hormone folliculostimulante humaine recombinante, acide ascorbique et sérum de souris femelle adulte) est recouvert d'huile de silicone stérilisée, qui empêche l'évaporation moyenne. Un follicule est placé au fond de chaque puits et maintenu dans un incubateur à 37 ℃, 5 % de CO 2 , puis déplacé dans un puits contenant du milieu frais jusqu'à 6 jours. Si des mesures de croissance sont prises visuellement, la distorsion due à la couche d'huile doit être prise en compte. Les follicules sont congelés ou fixés afin qu'une analyse plus approfondie puisse être effectuée.
Jumelé
En cultivant 2 follicules à proximité, les interactions follicule-follicule peuvent être examinées. Les follicules peuvent croître ensemble pour former une unité à deux follicules. Les follicules sont disséqués des ovaires comme ci-dessus, puis mis en contact les uns avec les autres par paires, dans un puits avec du milieu de culture folliculaire et de l'huile de silicone stérilisée. Des follicules provenant de différentes sources génétiques peuvent être co-cultivés afin que les origines des tissus puissent être différenciées au sein de la co-culture. Le milieu est remplacé tous les 2 jours et après 6 jours, la culture est fixée ou congelée pour un traitement ultérieur.
Co-culture follicule-ovaire
Cette méthode permet d'étudier les interactions follicule-ovaire. Les ovaires et les follicules sont disséqués comme ci-dessus, puis un follicule est mis en contact avec un pôle d'un ovaire néonatal sur une plaque. La plaque follicule-ovaire est cultivée dans un milieu de culture folliculaire à 37 °C, 5 % de CO 2 jusqu'à 5 jours. À ce stade, la co-culture est congelée ou fixée avant un traitement ultérieur. Pour faciliter la différenciation entre les origines tissulaires, l'ovaire et le follicule doivent provenir de sources génétiques différentes.
Utilisations des techniques de culture ovarienne
Études toxicologiques
À l'heure actuelle, les recherches dans le domaine de la toxicologie de la reproduction sont principalement menées in vivo , mais de nouvelles méthodes de culture ont été développées dans le but de permettre la croissance des follicules ovariens in vitro . Ces nouvelles méthodes nous permettent de cultiver des follicules ovariens isolés, des embryons, des ovaires (organe entier ou seulement une partie du tissu) et des cellules souches embryonnaires. Les cultures ovariennes sont utiles pour la recherche car elles peuvent nous permettre de reproduire le développement folliculaire systématique, l'ovulation périodique et l'atrésie folliculaire dans un environnement avec des conditions de culture modulées. La capacité des cultures ovariennes in vitro à détecter les dommages à l'ovaire et à ses structures spécialisées du follicules et ovocytes, permet un dépistage plus rapide des toxiques potentiels pour le développement et/ou la reproduction. Par conséquent, les systèmes de culture ovarienne sont devenus de plus en plus largement utilisés en biologie de la reproduction et en toxicologie.
La culture de l'ovaire entier ou de fragments d'ovaire permet d'évaluer divers paramètres de manière contrôlée et, par conséquent, a le potentiel pour des études de toxicité pour la reproduction plus complètes. Un grand avantage de la culture ovarienne est la capacité d'évaluer l'effet des médicaments sur le pool de follicules primordiaux qui constituent la réserve ovarienne. Cependant, cette stratégie est limitée en ce qui concerne la durée du temps de culture, car de courtes périodes peuvent ne pas être suffisantes pour assurer le développement folliculaire. Au contraire, les cellules peuvent être affectées négativement par des périodes de culture plus longues.
La plupart des études de toxicologie in vitro utilisent des modèles de souris et de rats femelles. Ces espèces ont été sélectionnées pour évaluer les effets indésirables des médicaments sur la fonction de reproduction et la fertilité, en raison de leur facilité de manipulation et de leur petite taille. De plus, ces espèces ont été bien caractérisées ; anatomiquement, physiologiquement et génétiquement. Leurs cycles de vie courts facilitent l'évaluation de la gestation, de l'allaitement et de la puberté. La pertinence des études animales pour l'évaluation des risques toxicologiques dans des populations humaines hétérogènes reste indéterminée car on ne sait pas si les résultats obtenus peuvent être extrapolés à l'homme.
Traitement de fertilité
L'utilisation de la maturation in vivo en culture ovarienne éliminerait le risque de syndrome d'hyperstimulation ovarienne pendant la FIV chez les patientes atteintes du syndrome des ovaires polykystiques (SOPK). Pour ceux sans SOPK, la maturation in vitro présente toujours des avantages car le processus est moins intense car la superovulation n'est pas requise. Les principes de la culture ovarienne peuvent être appliqués aux femmes résistantes à la FSH ou aux tumeurs sensibles aux œstrogènes. Par rapport à la FIV, les cellules utilisées pour la maturation in vitro sont récoltées à une taille plus petite, immatures et arrêtées au stade métaphase I de la méiose. Une fois dans le laboratoire, ils subissent une maturation jusqu'à la métaphase II.
Préservation de la fertilité
Le tissu ovarien peut être prélevé avant les traitements endommageant les ovaires et réimplanté à un stade ultérieur par cryoconservation. Cependant, cette méthode est associée à la récurrence de malignité chez les personnes atteintes de cancer de l'ovaire et de leucémie. En théorie, la culture de tissus ovariens est une méthode plus sûre pour produire des ovocytes matures pour la fécondation chez ces patientes.