Vecteur (biologie moléculaire) - Vector (molecular biology)

Pour d'autres utilisations, voir Vecteur .

Dans le clonage moléculaire , un vecteur est une molécule d'ADN utilisée comme véhicule pour transporter artificiellement du matériel génétique étranger dans une autre cellule , où il peut être répliqué et/ou exprimé (par exemple, plasmide , cosmide , phages Lambda ). Un vecteur contenant de l'ADN étranger est appelé ADN recombinant . Les quatre principaux types de vecteurs sont les plasmides , les vecteurs viraux , les cosmides et les chromosomes artificiels . Parmi ceux-ci, les vecteurs les plus couramment utilisés sont les plasmides. Tous les vecteurs modifiés ont en commun une origine de réplication , un site de clonage multiple et un marqueur sélectionnable .

Le vecteur lui-même est généralement une séquence d' ADN qui se compose d'un insert ( transgène ) et d'une séquence plus grande qui sert de "colonne vertébrale" du vecteur. Le but d'un vecteur qui transfère l'information génétique à une autre cellule est typiquement d'isoler, de multiplier ou d'exprimer l'insert dans la cellule cible. Tous les vecteurs peuvent être utilisés pour le clonage et sont donc des vecteurs de clonage , mais il existe également des vecteurs spécialement conçus pour le clonage, tandis que d'autres peuvent être conçus spécifiquement à d'autres fins, telles que la transcription et l'expression de protéines. Les vecteurs conçus spécifiquement pour l'expression du transgène dans la cellule cible sont appelés vecteurs d'expression et ont généralement une séquence promotrice qui pilote l'expression du transgène. Des vecteurs plus simples appelés vecteurs de transcription ne sont capables que d'être transcrits mais pas traduits : ils peuvent être répliqués dans une cellule cible mais non exprimés, contrairement aux vecteurs d'expression. Des vecteurs de transcription sont utilisés pour amplifier leur insert.

La manipulation de l'ADN est normalement réalisée sur des vecteurs E. coli , qui contiennent des éléments nécessaires à leur maintien dans E. coli . Cependant, les vecteurs peuvent également avoir des éléments qui leur permettent d'être maintenus dans un autre organisme tel que des cellules de levure, de plante ou de mammifère, et ces vecteurs sont appelés vecteurs navettes . De tels vecteurs ont des éléments bactériens ou viraux qui peuvent être transférés à l'organisme hôte non bactérien, cependant d'autres vecteurs appelés vecteurs intragéniques ont également été développés pour éviter le transfert de tout matériel génétique d'une espèce étrangère.

L'insertion d'un vecteur dans la cellule cible est généralement appelée transformation pour les cellules bactériennes, transfection pour les cellules eucaryotes , bien que l'insertion d'un vecteur viral soit souvent appelée transduction .

Caractéristiques

Plasmides

Article principal: vecteur plasmidique

Les plasmides sont des séquences d'ADN extrachromosomiques double brin et généralement circulaires qui sont capables de se répliquer en utilisant la machinerie de réplication de la cellule hôte. Les vecteurs plasmidiques consistent de manière minimaliste en une origine de réplication qui permet une réplication semi-indépendante du plasmide dans l'hôte. Les plasmides sont largement trouvés dans de nombreuses bactéries, par exemple dans Escherichia coli , mais peuvent également être trouvés chez quelques eucaryotes, par exemple dans des levures telles que Saccharomyces cerevisiae . Les plasmides bactériens peuvent être conjugatifs/transmissibles et non conjugatifs :

  • conjugatif - médie le transfert d'ADN par conjugaison et se propage donc rapidement parmi les cellules bactériennes d'une population ; par exemple, le plasmide F, de nombreux plasmides R et certains plasmides col.
  • non conjugatif - ne médie pas l'ADN par conjugaison, par exemple, de nombreux plasmides R et col.
Le plasmide pBR322 est l'un des premiers plasmides largement utilisé comme vecteur de clonage .

Les plasmides dotés de caractéristiques spécialement conçues sont couramment utilisés en laboratoire à des fins de clonage . Ces plasmides sont généralement non conjugatifs mais peuvent avoir de nombreuses autres caractéristiques, notamment un « site de clonage multiple » où de multiples sites de coupure d' enzymes de restriction permettent l'insertion d'un insert transgénique. Les bactéries contenant les plasmides peuvent générer des millions de copies du vecteur dans les bactéries en quelques heures, et les vecteurs amplifiés peuvent être extraits des bactéries pour une manipulation ultérieure. Les plasmides peuvent être utilisés spécifiquement comme vecteurs de transcription et ces plasmides peuvent manquer de séquences cruciales pour l'expression des protéines. Les plasmides utilisés pour l'expression des protéines, appelés vecteurs d'expression , incluraient des éléments pour la traduction de la protéine, tels qu'un site de liaison au ribosome , des codons de démarrage et d' arrêt .

Vecteurs viraux

Article principal : vecteur viral

Les vecteurs viraux sont généralement des virus génétiquement modifiés portant un ADN ou un ARN viral modifié qui a été rendu non infectieux, mais qui contiennent toujours des promoteurs viraux et également le transgène, permettant ainsi la traduction du transgène par l'intermédiaire d'un promoteur viral. Cependant, étant donné que les vecteurs viraux manquent fréquemment de séquences infectieuses, ils nécessitent des virus auxiliaires ou des lignées d'encapsidation pour une transfection à grande échelle. Les vecteurs viraux sont souvent conçus pour l'incorporation permanente de l'insert dans le génome de l'hôte et laissent ainsi des marqueurs génétiques distincts dans le génome de l'hôte après avoir incorporé le transgène. Par exemple, les rétrovirus laissent un modèle d' intégration rétrovirale caractéristique après insertion qui est détectable et indique que le vecteur viral s'est incorporé dans le génome de l'hôte.

Chromosomes artificiels

Article principal: Chromosome artificiel (homonymie)

Les chromosomes artificiels sont des chromosomes fabriqués dans le contexte des chromosomes artificiels de levure (YAC), des chromosomes artificiels bactériens (BAC) ou des chromosomes artificiels humains (HAC). Un chromosome artificiel peut porter un fragment d'ADN beaucoup plus gros que les autres vecteurs. Les YAC et les BAC peuvent porter un fragment d'ADN jusqu'à 300 000 nucléotides de long. Trois nécessités structurelles d'un chromosome artificiel comprennent une origine de réplication, un centromère et des séquences terminales télomériques.

Transcription

La transcription du gène cloné est un composant nécessaire du vecteur lorsque l'expression du gène est requise : un gène peut être amplifié par transcription pour générer plusieurs copies d' ARNm , la matrice sur laquelle la protéine peut être produite par traduction. Un plus grand nombre d'ARNm exprimerait une plus grande quantité de protéines, et le nombre de copies d'ARNm générées dépend du promoteur utilisé dans le vecteur. L'expression peut être constitutive, ce qui signifie que la protéine est produite constamment en arrière-plan, ou elle peut être inductible, la protéine n'étant exprimée que sous certaines conditions, par exemple lorsqu'un inducteur chimique est ajouté. Ces deux types d'expression différents dépendent des types de promoteur et d' opérateur utilisés.

Les promoteurs viraux sont souvent utilisés pour l'expression constitutive dans les plasmides et dans les vecteurs viraux car ils forcent normalement une transcription constante dans de nombreuses lignées et types cellulaires de manière fiable. L'expression inductible dépend de promoteurs qui répondent aux conditions d'induction : par exemple, le promoteur du virus de la tumeur mammaire murine n'initie la transcription qu'après l' application de dexaméthasone et le promoteur de choc thermique de la drosophilie n'initie qu'après des températures élevées.

Certains vecteurs sont conçus uniquement pour la transcription, par exemple pour la production d'ARNm in vitro . Ces vecteurs sont appelés vecteurs de transcription. Ils peuvent ne pas avoir les séquences nécessaires à la polyadénylation et à la terminaison, et ne peuvent donc pas être utilisés pour la production de protéines.

Expression

Article principal: vecteur d'expression

Les vecteurs d'expression produisent des protéines par la transcription de l'insert du vecteur suivie de la traduction de l' ARNm produit, ils nécessitent donc plus de composants que les vecteurs plus simples de transcription uniquement. L'expression dans un organisme hôte différent nécessiterait des éléments différents, bien qu'ils partagent des exigences similaires, par exemple un promoteur pour l'initiation de la transcription, un site de liaison ribosomique pour l'initiation de la traduction et des signaux de terminaison.

Vecteur d'expression des procaryotes

  • Promoteur - les promoteurs inductibles couramment utilisés sont des promoteurs dérivés de l' opéron lac et du promoteur T7 . D'autres promoteurs puissants utilisés comprennent le promoteur Trp et le Tac-Promoter , qui sont un hybride des promoteurs Trp et Lac Operon.
  • Site de liaison du ribosome (RBS) - suit le promoteur et favorise une traduction efficace de la protéine d'intérêt.
  • Site d'initiation de la traduction - Séquence Shine-Dalgarno enfermée dans le RBS, 8 paires de bases en amont du codon d'initiation AUG.

Vecteur d'expression eucaryotes

Les vecteurs d'expression eucaryotes nécessitent des séquences qui codent pour :

  • Queue de polyadénylation : crée une queue de polyadénylation à l'extrémité du pré-ARNm transcrit qui protège l'ARNm des exonucléases et assure la terminaison transcriptionnelle et traductionnelle : stabilise la production d'ARNm.
  • Longueur UTR minimale : les UTR contiennent des caractéristiques spécifiques qui peuvent entraver la transcription ou la traduction, et donc les UTR les plus courtes ou aucune sont codées dans des vecteurs d'expression optimaux.
  • Séquence Kozak : les vecteurs doivent coder pour une séquence Kozak dans l'ARNm, qui assemble le ribosome pour la traduction de l'ARNm.

Caractéristiques

Les vecteurs modernes construits artificiellement contiennent des composants essentiels trouvés dans tous les vecteurs, et peuvent contenir d'autres caractéristiques supplémentaires trouvées uniquement dans certains vecteurs :

  • Origine de réplication : Nécessaire à la réplication et au maintien du vecteur dans la cellule hôte.
  • Promoteur : Les promoteurs sont utilisés pour piloter la transcription du transgène du vecteur ainsi que des autres gènes du vecteur tels que le gène de résistance aux antibiotiques. Certains vecteurs de clonage n'ont pas besoin d'avoir un promoteur pour l'insert cloné mais c'est un composant essentiel des vecteurs d'expression afin que le produit cloné puisse être exprimé.
  • Site de clonage : il peut s'agir d'un site de clonage multiple ou d'autres caractéristiques permettant l'insertion d'ADN étranger dans le vecteur par ligature .
  • Marqueurs génétiques : Les marqueurs génétiques des vecteurs viraux permettent de confirmer que le vecteur s'est intégré à l'ADN génomique de l'hôte.
  • Résistance aux antibiotiques : les vecteurs avec des cadres de lecture ouverts de résistance aux antibiotiques permettent la survie des cellules qui ont absorbé le vecteur dans des milieux de croissance contenant des antibiotiques grâce à la sélection d'antibiotiques.
  • Epitope : Certains vecteurs peuvent contenir une séquence pour un épitope spécifique qui peut être incorporé dans la protéine exprimée. Il permet l'identification des anticorps des cellules exprimant la protéine cible.
  • Gènes rapporteurs : certains vecteurs peuvent contenir un gène rapporteur qui permet l'identification du plasmide contenant une séquence d'ADN insérée. Un exemple est lacZ-α qui code pour le fragment N-terminal de la -galactosidase , une enzyme qui digère le galactose . Un site de clonage multiple est situé dans lacZ-α et un insert ligaturé avec succès dans le vecteur perturbera la séquence du gène, entraînant une β-galactosidase inactive. Les cellules contenant un vecteur avec un insert peuvent être identifiées en utilisant une sélection bleu/blanc en cultivant des cellules dans un milieu contenant un analogue du galactose ( X-gal ). Les cellules exprimant la β-galactosidase (et ne contiennent donc pas d'insert) apparaissent sous forme de colonies bleues. Les colonies blanches seraient sélectionnées comme celles pouvant contenir un insert. D'autres rapporteurs couramment utilisés comprennent la protéine fluorescente verte et la luciférase .
  • Séquence de ciblage : les vecteurs d'expression peuvent inclure le codage d'une séquence de ciblage dans la protéine finie qui dirige la protéine exprimée vers un organite spécifique dans la cellule ou un emplacement spécifique tel que l' espace périplasmique des bactéries.
  • Étiquettes de purification de protéines : Certains vecteurs d'expression incluent des protéines ou des séquences peptidiques qui permettent une purification plus facile de la protéine exprimée. Les exemples incluent la polyhistidine-tag , la glutathion-S-transférase et la protéine de liaison au maltose . Certaines de ces balises peuvent également permettre une solubilité accrue de la protéine cible. La protéine cible est fusionnée au marqueur protéique, mais un site de clivage par protéase positionné dans la région de liaison polypeptidique entre la protéine et le marqueur permet au marqueur d'être retiré ultérieurement.

Voir également

Les références

Lectures complémentaires

  • Freshney IR (2005-07-29). Culture de cellules animales : Un manuel de technique de base . Hoboken, New Jersey : John Wiley & Sons, Inc. ISBN 978-0-471-45329-1.

Liens externes