Transformation (génétique) - Transformation (genetics)
En biologie moléculaire et en génétique , la transformation est l' altération génétique d'une cellule résultant de l'absorption et de l'incorporation directes de matériel génétique exogène de son environnement à travers la ou les membranes cellulaires . Pour que la transformation ait lieu, la bactérie receveuse doit être dans un état de compétence , qui peut se produire dans la nature en réponse à des conditions environnementales limitées dans le temps, telles que la famine et la densité cellulaire, et peut également être induite en laboratoire.
La transformation est l'un des trois processus de transfert horizontal de gènes , dans lequel le matériel génétique exogène passe d'une bactérie à une autre, les deux autres étant la conjugaison (transfert de matériel génétique entre deux cellules bactériennes en contact direct) et la transduction (injection d'ADN étranger par un virus bactériophage dans la bactérie hôte). Lors de la transformation, le matériel génétique traverse le milieu intermédiaire et l'absorption dépend entièrement de la bactérie receveuse.
En 2014, environ 80 espèces de bactéries étaient connues pour être capables de transformation, à peu près également réparties entre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives ; le nombre pourrait être surestimé puisque plusieurs des rapports sont étayés par des documents uniques.
« Transformation » peut également être utilisé pour décrire l'insertion d'un nouveau matériel génétique dans des cellules non bactériennes, y compris des cellules animales et végétales ; cependant, parce que la « transformation » a une signification particulière par rapport aux cellules animales, indiquant la progression vers un état cancéreux, le processus est généralement appelé « transfection ».
Histoire
La transformation dans les bactéries a été démontrée pour la première fois en 1928 par le bactériologiste britannique Frederick Griffith . Griffith souhaitait déterminer si des injections de bactéries tuées par la chaleur pouvaient être utilisées pour vacciner des souris contre la pneumonie. Cependant, il a découvert qu'une souche non virulente de Streptococcus pneumoniae pouvait devenir virulente après avoir été exposée à des souches virulentes tuées par la chaleur. Griffith a émis l'hypothèse qu'un " principe de transformation " de la souche tuée par la chaleur était responsable de la virulence de la souche inoffensive. En 1944, ce "principe transformateur" a été identifié comme étant génétique par Oswald Avery , Colin MacLeod et Maclyn McCarty . Ils ont isolé l'ADN d'une souche virulente de S. pneumoniae et en utilisant uniquement cet ADN, ils ont pu rendre virulente une souche inoffensive. Ils ont appelé cette absorption et l' incorporation de l' ADN par des bactéries « transformation » (Voir expérience Avery-MacLeod-McCarty ) Les résultats des expériences de Avery et al. Furent d'abord reçu sceptiquement par la communauté scientifique et il a fallu attendre le développement de la génétique marqueurs et la découverte d'autres méthodes de transfert génétique ( conjugaison en 1947 et transduction en 1953) par Joshua Lederberg que les expériences d'Avery ont été acceptées.
On pensait à l'origine qu'Escherichia coli , un organisme de laboratoire couramment utilisé, était réfractaire à la transformation. Cependant, en 1970, Morton Mandel et Akiko Higa ont montré qu'E. coli peut être induit à absorber l'ADN du bactériophage sans utiliser de phage auxiliaire après traitement avec une solution de chlorure de calcium. Deux ans plus tard, en 1972, Stanley Norman Cohen , Annie Chang et Leslie Hsu montrèrent que CaCl
2le traitement est également efficace pour la transformation de l'ADN plasmidique. La méthode de transformation par Mandel et Higa a ensuite été améliorée par Douglas Hanahan . La découverte de la compétence induite artificiellement dans E. coli a créé une procédure efficace et pratique pour transformer les bactéries qui permet des méthodes de clonage moléculaire plus simples en biotechnologie et en recherche , et c'est maintenant une procédure de laboratoire couramment utilisée.
La transformation par électroporation a été développée à la fin des années 1980, augmentant l'efficacité de la transformation in vitro et augmentant le nombre de souches bactériennes pouvant être transformées. La transformation de cellules animales et végétales a également été étudiée avec la première souris transgénique créée en injectant un gène pour une hormone de croissance de rat dans un embryon de souris en 1982. En 1897, une bactérie causant des tumeurs végétales, Agrobacterium tumefaciens , a été découverte et au début Dans les années 1970, l'agent inducteur de tumeur s'est avéré être un plasmide d' ADN appelé plasmide Ti . En supprimant les gènes du plasmide à l'origine de la tumeur et en ajoutant de nouveaux gènes, les chercheurs ont pu infecter les plantes avec A. tumefaciens et laisser les bactéries insérer l'ADN de leur choix dans les génomes des plantes. Toutes les cellules végétales ne sont pas sensibles à l'infection par A. tumefaciens , d'autres méthodes ont donc été développées, notamment l' électroporation et la micro-injection . Le bombardement de particules a été rendu possible grâce à l'invention du Biolistic Particle Delivery System (canon à gènes) par John Sanford dans les années 1980.
Définitions
La transformation est l'une des trois formes de transfert horizontal de gènes qui se produisent dans la nature chez les bactéries, dans lesquelles l'ADN codant pour un trait passe d'une bactérie à une autre et est intégré dans le génome receveur par recombinaison homologue ; les deux autres sont la transduction , réalisée au moyen d'un bactériophage , et la conjugaison , dans laquelle un gène est transmis par contact direct entre bactéries. Lors de la transformation, le matériel génétique traverse le milieu intermédiaire et l'absorption dépend entièrement de la bactérie receveuse.
La compétence fait référence à un état temporaire de capacité à absorber l'ADN exogène de l'environnement ; elle peut être induite en laboratoire.
Il semble qu'il s'agisse d'un ancien processus hérité d'un ancêtre procaryote commun qui constitue une adaptation bénéfique pour favoriser la réparation par recombinaison des dommages à l'ADN, en particulier des dommages acquis dans des conditions de stress. La transformation génétique naturelle semble être une adaptation pour la réparation des dommages à l'ADN qui génère également une diversité génétique .
La transformation a été étudiée chez des espèces de bactéries Gram-négatives importantes sur le plan médical telles que Helicobacter pylori , Legionella pneumophila , Neisseria meningitidis , Neisseria gonorrhoeae , Haemophilus influenzae et Vibrio cholerae . Il a également été étudié chez des espèces à Gram négatif présentes dans le sol telles que Pseudomonas stutzeri , Acinetobacter baylyi , et des pathogènes végétaux à Gram négatif tels que Ralstonia solanacearum et Xylella fastidiosa . La transformation parmi les bactéries Gram-positives a été étudiée chez des espèces médicalement importantes telles que Streptococcus pneumoniae , Streptococcus mutans , Staphylococcus aureus et Streptococcus sanguinis et dans la bactérie du sol Gram-positive Bacillus subtilis . Il a également été signalé chez au moins 30 espèces de protéobactéries réparties dans les classes alpha, bêta, gamma et epsilon . Les protéobactéries les mieux étudiées en ce qui concerne la transformation sont les agents pathogènes humains médicalement importants Neisseria gonorrhoeae (classe bêta), Haemophilus influenzae (classe gamma) et Helicobacter pylori (classe epsilon)
« Transformation » peut également être utilisé pour décrire l'insertion d'un nouveau matériel génétique dans des cellules non bactériennes, y compris des cellules animales et végétales ; cependant, parce que la « transformation » a une signification particulière par rapport aux cellules animales, indiquant la progression vers un état cancéreux, le processus est généralement appelé « transfection ».
Compétence naturelle et transformation
En 2014, environ 80 espèces de bactéries étaient connues pour être capables de transformation, à peu près également réparties entre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives ; le nombre pourrait être surestimé puisque plusieurs des rapports sont étayés par des documents uniques.
Les bactéries naturellement compétentes portent des ensembles de gènes qui fournissent la machinerie protéique pour amener l'ADN à travers la ou les membranes cellulaires. Le transport de l'ADN exogène dans les cellules peut nécessiter des protéines impliquées dans l'assemblage des pili de type IV et du système de sécrétion de type II , ainsi qu'un complexe translocase d' ADN au niveau de la membrane cytoplasmique.
En raison des différences de structure de l'enveloppe cellulaire entre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, il existe des différences dans les mécanismes d'absorption d'ADN dans ces cellules, mais la plupart d'entre elles partagent des caractéristiques communes impliquant des protéines apparentées. L'ADN se lie d'abord à la surface des cellules compétentes sur un récepteur d'ADN et traverse la membrane cytoplasmique via l'ADN translocase. Seul l'ADN simple brin peut le traverser, l'autre brin étant dégradé par les nucléases au cours du processus. L'ADN simple brin transloqué peut ensuite être intégré dans les chromosomes bactériens par un processus dépendant de RecA . Dans les cellules Gram-négatives, en raison de la présence d'une membrane supplémentaire, l'ADN nécessite la présence d'un canal formé par les sécrétines sur la membrane externe. Pilin peut être requis pour la compétence, mais son rôle est incertain. L'absorption d'ADN n'est généralement pas spécifique d'une séquence, bien que chez certaines espèces la présence de séquences d'absorption d'ADN spécifiques puisse faciliter une absorption efficace d'ADN.
Transformation naturelle
La transformation naturelle est une adaptation bactérienne pour le transfert d'ADN qui dépend de l'expression de nombreux gènes bactériens dont les produits semblent être responsables de ce processus. En général, la transformation est un processus de développement complexe et exigeant en énergie. Pour qu'une bactérie puisse se lier, absorber et recombiner l'ADN exogène dans son chromosome, elle doit devenir compétente, c'est-à-dire entrer dans un état physiologique particulier. Le développement des compétences chez Bacillus subtilis nécessite l'expression d'environ 40 gènes. L'ADN intégré dans le chromosome hôte est généralement (mais à de rares exceptions près) dérivé d'une autre bactérie de la même espèce, et est donc homologue au chromosome résident.
Chez B. subtilis, la longueur de l'ADN transféré est supérieure à 1271 kb (plus de 1 million de bases). La longueur transférée est probablement de l'ADN double brin et représente souvent plus d'un tiers de la longueur totale du chromosome de 4215 kb. Il semble qu'environ 7 à 9 % des cellules receveuses occupent un chromosome entier.
La capacité de transformation naturelle semble se produire chez un certain nombre de procaryotes, et jusqu'à présent, 67 espèces procaryotes (dans sept phylums différents) sont connues pour subir ce processus.
La compétence pour la transformation est typiquement induite par une densité cellulaire élevée et/ou une limitation nutritionnelle, conditions associées à la phase stationnaire de la croissance bactérienne. La transformation chez Haemophilus influenzae se produit le plus efficacement à la fin de la croissance exponentielle à mesure que la croissance bactérienne approche de la phase stationnaire. La transformation chez Streptococcus mutans , ainsi que chez de nombreux autres streptocoques, se produit à une densité cellulaire élevée et est associée à la formation de biofilm . La compétence chez B. subtilis est induite vers la fin de la croissance logarithmique, en particulier dans des conditions de limitation des acides aminés. De même, chez Micrococcus luteus (un représentant du phylum des Actinobacteria moins bien étudié ), la compétence se développe pendant la phase de croissance exponentielle mi-tardive et est également déclenchée par la privation d'acides aminés.
En libérant l'ADN intact de l'hôte et du plasmide, on pense que certains bactériophages contribuent à la transformation.
La transformation, en tant qu'adaptation pour la réparation de l'ADN
La compétence est spécifiquement induite par des conditions d'endommagement de l'ADN. Par exemple, la transformation est induite chez Streptococcus pneumoniae par les agents endommageant l'ADN, la mitomycine C (un agent de réticulation de l'ADN) et la fluoroquinolone (un inhibiteur de la topoisomérase qui provoque des cassures double brin). Chez B. subtilis , la transformation est augmentée par la lumière UV, un agent endommageant l'ADN. Chez Helicobacter pylori , la ciprofloxacine, qui interagit avec l'ADN gyrase et introduit des cassures double brin, induit l'expression de gènes de compétence, augmentant ainsi la fréquence de transformation. À l'aide de Legionella pneumophila , Charpentier et al. testé 64 molécules toxiques pour déterminer lesquelles d'entre elles induisent la compétence. Parmi ceux-ci, seulement six, tous des agents endommageant l'ADN, ont provoqué une forte induction. Ces agents endommageant l'ADN étaient la mitomycine C (qui provoque des réticulations inter-brin de l'ADN), la norfloxacine, l'ofloxacine et l'acide nalidixique (inhibiteurs de l'ADN gyrase qui provoquent des cassures double brin), la bicyclomycine (cause des cassures simple et double brin) et l'hydroxyurée (induit une oxydation des bases d'ADN). La lumière UV a également induit une compétence chez L. pneumophila . Charpentier et al. ont suggéré que la compétence pour la transformation a probablement évolué comme une réponse aux dommages à l'ADN.
Les bactéries à croissance logarithmique diffèrent des bactéries en phase stationnaire en ce qui concerne le nombre de copies du génome présentes dans la cellule, ce qui a des implications sur la capacité d'effectuer un important processus de réparation de l'ADN . Au cours de la croissance logarithmique, deux copies ou plus d'une région particulière du chromosome peuvent être présentes dans une cellule bactérienne, car la division cellulaire ne correspond pas précisément à la réplication du chromosome. Le processus de réparation par recombinaison homologue (HRR) est un processus clé de réparation de l'ADN qui est particulièrement efficace pour réparer les dommages double brin, tels que les cassures double brin. Ce processus dépend d'un deuxième chromosome homologue en plus du chromosome endommagé. Au cours de la croissance logarithmique, un dommage à l'ADN dans un chromosome peut être réparé par HRR en utilisant les informations de séquence de l'autre chromosome homologue. Une fois que les cellules approchent de la phase stationnaire, cependant, elles n'ont généralement qu'une seule copie du chromosome, et HRR nécessite l'entrée d'un modèle homologue de l'extérieur de la cellule par transformation.
Pour tester si la fonction adaptative de la transformation est la réparation des dommages à l'ADN, une série d'expériences a été réalisée en utilisant B. subtilis irradié par la lumière UV comme agent dommageable (examiné par Michod et al. et Bernstein et al.) Les résultats de ces des expériences ont indiqué que la transformation de l'ADN agit pour réparer les dommages potentiellement mortels de l'ADN introduits par la lumière UV dans l'ADN du receveur. Le processus particulier responsable de la réparation était probablement le HRR. La transformation chez les bactéries peut être considérée comme un processus sexuel primitif, car elle implique l'interaction d'ADN homologue de deux individus pour former un ADN recombinant qui est transmis aux générations suivantes. La transformation bactérienne chez les procaryotes pourrait avoir été le processus ancestral qui a donné naissance à la reproduction sexuée méiotique chez les eucaryotes (voir Évolution de la reproduction sexuée ; Méiose .)
Méthodes et mécanismes de transformation en laboratoire
Bactérien
La compétence artificielle peut être induite dans des procédures de laboratoire qui impliquent de rendre la cellule perméable passivement à l'ADN en l'exposant à des conditions qui ne se produisent pas normalement dans la nature. Typiquement, les cellules sont incubées dans une solution contenant des cations divalents (souvent du chlorure de calcium ) à froid, avant d'être exposées à une impulsion thermique (choc thermique). Le chlorure de calcium perturbe partiellement la membrane cellulaire, ce qui permet à l'ADN recombinant d'entrer dans la cellule hôte. Les cellules capables de capter l'ADN sont appelées cellules compétentes.
Il a été découvert que la croissance de bactéries Gram-négatives dans 20 mM de Mg réduit le nombre de liaisons protéine- lipopolysaccharide en augmentant le rapport des liaisons ioniques aux liaisons covalentes, ce qui augmente la fluidité membranaire, facilitant la transformation. Le rôle des lipopolysaccharides ici est vérifié à partir de l'observation que les chaînes latérales O plus courtes sont transformées plus efficacement - peut-être en raison de l'amélioration de l'accessibilité de l'ADN.
La surface des bactéries telles que E. coli est chargée négativement en raison des phospholipides et des lipopolysaccharides sur sa surface cellulaire, et l'ADN est également chargé négativement. Une fonction du cation divalent serait donc de protéger les charges en coordonnant les groupes phosphate et d'autres charges négatives, permettant ainsi à une molécule d'ADN d'adhérer à la surface cellulaire.
L'entrée de l'ADN dans les cellules d' E. coli se fait par des canaux connus sous le nom de zones d'adhésion ou jonction de Bayer, une cellule typique portant jusqu'à 400 de ces zones. Leur rôle a été établi lorsque la cobalamine (qui utilise également ces canaux) s'est avérée inhiber de manière compétitive l'absorption d'ADN. Un autre type de canal impliqué dans l'absorption d'ADN consiste en poly (HB):poly P:Ca. Dans ce poly (HB) est prévu pour envelopper l'ADN (lui-même un polyphosphate), et est porté dans un bouclier formé par des ions Ca.
Il est suggéré que l'exposition des cellules à des cations divalents à froid peut également modifier ou affaiblir la structure de la surface cellulaire, la rendant plus perméable à l'ADN. On pense que l'impulsion de chaleur crée un déséquilibre thermique à travers la membrane cellulaire, ce qui oblige l'ADN à pénétrer dans les cellules à travers les pores cellulaires ou la paroi cellulaire endommagée.
L'électroporation est une autre méthode de promotion de la compétence. Dans cette méthode, les cellules sont brièvement choquées avec un champ électrique de 10 à 20 kV /cm, qui est censé créer des trous dans la membrane cellulaire à travers lesquels l'ADN plasmidique peut entrer. Après le choc électrique, les trous sont rapidement fermés par les mécanismes de réparation membranaire de la cellule.
Levure
La plupart des espèces de levure , y compris Saccharomyces cerevisiae , peuvent être transformées par l'ADN exogène dans l'environnement. Plusieurs méthodes ont été développées pour faciliter cette transformation à haute fréquence en laboratoire.
- Les cellules de levure peuvent être traitées avec des enzymes pour dégrader leurs parois cellulaires, produisant des sphéroplastes . Ces cellules sont très fragiles mais absorbent l'ADN étranger à un taux élevé.
- L'exposition de cellules de levure intactes à des cations alcalins tels que ceux du césium ou du lithium permet aux cellules d'absorber l'ADN plasmidique. Des protocoles ultérieurs ont adapté cette méthode de transformation, en utilisant de l'acétate de lithium , du polyéthylène glycol et de l'ADN simple brin. Dans ces protocoles, l'ADN simple brin se lie préférentiellement à la paroi cellulaire de la levure, empêchant l'ADN plasmidique de le faire et le laissant disponible pour la transformation.
- Electroporation : Formation de trous transitoires dans les membranes cellulaires à l'aide d'un choc électrique ; cela permet à l'ADN d'entrer comme décrit ci-dessus pour les bactéries.
- La digestion enzymatique ou l'agitation avec des billes de verre peuvent également être utilisées pour transformer des cellules de levure.
Efficacité – Différents genres et espèces de levure absorbent l'ADN étranger avec des efficacités différentes. De plus, la plupart des protocoles de transformation ont été développés pour la levure de boulangerie, S. cerevisiae , et peuvent donc ne pas être optimaux pour d'autres espèces. Même au sein d'une même espèce, différentes souches ont des efficacités de transformation différentes, parfois différentes de trois ordres de grandeur. Par exemple, lorsque des souches de S. cerevisiae ont été transformées avec 10 ug de plasmide YEp13, la souche DKD-5D-H a donné entre 550 et 3115 colonies tandis que la souche OS1 a donné moins de cinq colonies.
Les plantes
Un certain nombre de méthodes sont disponibles pour transférer l'ADN dans les cellules végétales. Certaines méthodes à médiation vectorielle sont :
- La transformation médiée par Agrobacterium est la transformation végétale la plus facile et la plus simple. Les tissus végétaux (souvent des feuilles) sont coupés en petits morceaux, par exemple 10x10 mm, et trempés pendant dix minutes dans un fluide contenant Agrobacterium en suspension. Les bactéries s'attacheront à de nombreuses cellules végétales exposées par la coupe. Les cellules végétales sécrètent des composés phénoliques liés à la plaie qui à leur tour agissent pour réguler positivement l'opéron de virulence de l'Agrobacterium. L'opéron de virulence comprend de nombreux gènes qui codent pour des protéines qui font partie d'un système de sécrétion de type IV qui exporte les protéines et l'ADN de la bactérie (délimités par des motifs de reconnaissance spécifiques appelés séquences de bordure et excisés en un seul brin du plasmide de virulence) dans la plante cellule à travers une structure appelée pilus. L'ADN transféré (appelé ADN-T) est piloté jusqu'au noyau de la cellule végétale par des signaux de localisation nucléaire présents dans la protéine d'Agrobacterium VirD2, qui est attachée de manière covalente à l'extrémité de l'ADN-T à la bordure droite (RB). La manière exacte dont l'ADN-T est intégré dans l'ADN génomique de la plante hôte est un domaine actif de la recherche en biologie végétale. En supposant qu'un marqueur de sélection (tel qu'un gène de résistance aux antibiotiques) a été inclus dans l'ADN-T, le tissu végétal transformé peut être cultivé sur des milieux sélectifs pour produire des pousses. Les pousses sont ensuite transférées dans un milieu différent pour favoriser la formation de racines. Une fois que les racines commencent à pousser à partir de la pousse transgénique, les plantes peuvent être transférées dans le sol pour terminer un cycle de vie normal (faire des graines). Les graines de cette première plante (appelée T1, pour première génération transgénique) peuvent être plantées sur un sélectif (contenant un antibiotique), ou si un gène de résistance aux herbicides a été utilisé, pourraient alternativement être plantées dans le sol, puis traitées ultérieurement avec un herbicide pour tuer les ségrégants de type sauvage. Certaines espèces de plantes, comme Arabidopsis thaliana, peuvent être transformées en trempant les fleurs ou la plante entière, dans une suspension d' Agrobacterium tumefaciens , typiquement la souche C58 (C=Cherry, 58=1958, l'année où cette souche particulière d' A. tumefaciens a été isolé d'un cerisier dans un verger de l'Université Cornell à Ithaca, New York). Bien que de nombreuses plantes restent récalcitrantes à la transformation par cette méthode, des recherches sont en cours et continuent d'ajouter à la liste les espèces qui ont été modifiées avec succès de cette manière.
- Transformation virale ( transduction ) : empaqueter le matériel génétique souhaité dans un virus végétal approprié et permettre à ce virus modifié d'infecter la plante. Si le matériel génétique est de l'ADN, il peut se recombiner avec les chromosomes pour produire des cellules transformantes. Cependant, les génomes de la plupart des virus végétaux sont constitués d' ARN simple brin qui se réplique dans le cytoplasme de la cellule infectée. Pour de tels génomes, cette méthode est une forme de transfection et non une véritable transformation, puisque les gènes insérés n'atteignent jamais le noyau de la cellule et ne s'intègrent pas dans le génome hôte. La descendance des plantes infectées est exempte de virus et également exempte du gène inséré.
Certaines méthodes sans vecteur incluent :
- Pistolet à gènes : Également appelé bombardement de particules, bombardement de microprojectiles ou biolistique. Des particules d'or ou de tungstène sont recouvertes d'ADN puis injectées dans de jeunes cellules végétales ou des embryons végétaux. Une partie du matériel génétique restera dans les cellules et les transformera. Cette méthode permet également la transformation des plastes végétaux. L' efficacité de la transformation est inférieure à celle de la transformation médiée par Agrobacterium , mais la plupart des plantes peuvent être transformées avec cette méthode.
- Electroporation : Formation de trous transitoires dans les membranes cellulaires à l'aide d'impulsions électriques à haute intensité de champ ; cela permet à l'ADN d'entrer comme décrit ci-dessus pour les bactéries.
Champignons
Il existe des méthodes pour produire des champignons transgéniques, la plupart étant analogues à celles utilisées pour les plantes. Cependant, les champignons doivent être traités différemment en raison de certaines de leurs caractéristiques microscopiques et biochimiques :
- Un problème majeur est l' état dicaryotique dans lequel se trouvent certaines parties de certains champignons; les cellules dicaryotes contiennent deux noyaux haploïdes, un de chaque champignon parent. Si un seul d'entre eux se transforme, ce qui est la règle, le pourcentage de noyaux transformés diminue après chaque sporulation .
- Les parois cellulaires fongiques sont assez épaisses, ce qui entrave l'absorption de l'ADN, de sorte qu'une élimination (partielle) est souvent nécessaire ; la dégradation complète, qui est parfois nécessaire, donne des protoplastes .
- Les champignons mycéliens sont constitués d' hyphes filamenteux , qui sont, le cas échéant, séparés par des parois cellulaires internes interrompues par des pores suffisamment gros pour permettre aux nutriments et aux organites, parfois même aux noyaux, de traverser chaque hyphe. En conséquence, les cellules individuelles ne peuvent généralement pas être séparées. Ceci est problématique car les cellules transformées voisines peuvent rendre les cellules non transformées immunisées aux traitements de sélection, par exemple en fournissant des nutriments ou des protéines pour la résistance aux antibiotiques.
- De plus, la croissance (et donc la mitose) de ces champignons se produit exclusivement à l'extrémité de leurs hyphes, ce qui peut également entraîner des problèmes.
Comme indiqué précédemment, un éventail de méthodes utilisées pour la transformation des plantes fonctionnent également chez les champignons :
- Agrobacterium est non seulement capable d'infecter les plantes mais aussi les champignons, cependant, contrairement aux plantes, les champignons ne sécrètent pas les composés phénoliques nécessaires pour déclencher Agrobacterium de sorte qu'il faut les ajouter, par exemple sous forme d' acétosyringone .
- Grâce au développement d'un système d'expression pour les petits ARN dans les champignons, l'introduction d'un système CRISPR/CAS9 dans les cellules fongiques est devenue possible. En 2016, l'USDA a déclaré qu'il ne réglementerait pas une souche de champignon de Paris éditée avec CRISPR/CAS9 pour empêcher le brunissement du corps du fruit, provoquant une large discussion sur la mise sur le marché de cultures éditées par CRISPR/CAS9.
- Les méthodes physiques telles que l'électroporation, la biolistique (« gene gun »), la sonoporation qui utilise la cavitation de bulles de gaz produites par les ultrasons pour pénétrer la membrane cellulaire, etc. sont également applicables aux champignons.
Animaux
L'introduction d'ADN dans des cellules animales est généralement appelée transfection et est discutée dans l'article correspondant.
Aspects pratiques de la transformation en biologie moléculaire
La découverte de la compétence induite artificiellement chez les bactéries permet à des bactéries telles que Escherichia coli d'être utilisées comme hôte pratique pour la manipulation de l'ADN ainsi que pour l'expression de protéines. Typiquement, les plasmides sont utilisés pour la transformation dans E. coli . Afin d'être maintenue de manière stable dans la cellule, une molécule d'ADN plasmidique doit contenir une origine de réplication , qui lui permet d'être répliquée dans la cellule indépendamment de la réplication du propre chromosome de la cellule.
L'efficacité avec laquelle une culture compétente peut absorber l'ADN exogène et exprimer ses gènes est connue sous le nom d' efficacité de transformation et est mesurée en unité formant colonie (ufc) par g d'ADN utilisé. Une efficacité de transformation de 1 x 10 8 cfu/μg pour un petit plasmide comme pUC19 est à peu près équivalente à 1 sur 2000 molécules du plasmide utilisé à transformer.
Dans la transformation du chlorure de calcium , les cellules sont préparées en refroidissant les cellules en présence de Ca .2+
(en CaCl
2solution), rendant la cellule perméable à l'ADN plasmidique . Les cellules sont incubées sur de la glace avec l'ADN, puis brièvement soumises à un choc thermique (par exemple, à 42 °C pendant 30 à 120 secondes). Cette méthode fonctionne très bien pour l'ADN plasmidique circulaire. Les préparations non commerciales devraient normalement donner 10 6 à 10 7 transformants par microgramme de plasmide; une mauvaise préparation sera d'environ 10 4 /μg ou moins, mais une bonne préparation de cellules compétentes peut donner jusqu'à ~10 8 colonies par microgramme de plasmide. Des protocoles, cependant, existent pour fabriquer des cellules supercompétentes qui peuvent donner une efficacité de transformation de plus de 10 9 . La méthode chimique, cependant, ne fonctionne généralement pas bien pour l'ADN linéaire, comme les fragments d'ADN chromosomique, probablement parce que les enzymes exonucléases natives de la cellule dégradent rapidement l'ADN linéaire. En revanche, les cellules naturellement compétentes sont généralement transformées plus efficacement avec de l'ADN linéaire qu'avec de l'ADN plasmidique.
L'efficacité de la transformation à l'aide du CaCl
2méthode diminue avec la taille du plasmide, et l'électroporation peut donc être une méthode plus efficace pour l'absorption de gros ADN plasmidique. Les cellules utilisées dans l'électroporation doivent d'abord être préparées en lavant dans de l'eau froide bidistillée pour éliminer les particules chargées qui peuvent créer des étincelles pendant le processus d'électroporation.
Sélection et criblage en transformation plasmidique
Étant donné que la transformation produit généralement un mélange de relativement peu de cellules transformées et d'une abondance de cellules non transformées, une méthode est nécessaire pour sélectionner les cellules qui ont acquis le plasmide. Le plasmide nécessite donc un marqueur sélectionnable de telle sorte que les cellules sans le plasmide puissent être tuées ou voir leur croissance arrêtée. La résistance aux antibiotiques est le marqueur le plus couramment utilisé pour les procaryotes. Le plasmide transformant contient un gène qui confère une résistance à un antibiotique auquel les bactéries sont autrement sensibles. Le mélange de cellules traitées est cultivé sur des milieux qui contiennent l'antibiotique afin que seules les cellules transformées puissent se développer. Une autre méthode de sélection est l'utilisation de certains marqueurs auxotrophes qui peuvent compenser une incapacité à métaboliser certains acides aminés, nucléotides ou sucres. Cette méthode nécessite l'utilisation de souches mutées de manière appropriée qui sont déficientes dans la synthèse ou l'utilité d'une biomolécule particulière, et les cellules transformées sont cultivées dans un milieu qui permet uniquement aux cellules contenant le plasmide de croître.
Dans une expérience de clonage, un gène peut être inséré dans un plasmide utilisé pour la transformation. Cependant, dans une telle expérience, tous les plasmides peuvent ne pas contenir un gène inséré avec succès. Des techniques supplémentaires peuvent donc être employées davantage pour cribler des cellules transformées qui contiennent un plasmide avec l'insert. Les gènes rapporteurs peuvent être utilisés comme marqueurs , tels que le gène lacZ qui code pour la -galactosidase utilisée dans le criblage bleu-blanc . Cette méthode de criblage repose sur le principe de l' α- complémentation , où un fragment du lacZ gène ( lacZa ) dans le plasmide peut compléter un autre mutant lacZ gène ( lacZΔM15 ) dans la cellule. Les deux gènes produisent par eux-mêmes des peptides non fonctionnels, cependant, lorsqu'ils sont exprimés ensemble, comme lorsqu'un plasmide contenant lacZ-α est transformé dans des cellules lacZΔM15 , ils forment une β-galactosidase fonctionnelle. La présence d'une β-galactosidase active peut être détectée lorsque les cellules sont cultivées dans des plaques contenant X-gal , formant des colonies bleues caractéristiques. Cependant, le site de clonage multiple , où un gène d'intérêt peut être ligaturé dans le vecteur plasmidique , est situé dans le gène lacZα . Une ligature réussie perturbe donc le gène lacZα , et aucune β-galactosidase fonctionnelle ne peut se former, ce qui entraîne des colonies blanches. Les cellules contenant un insert ligaturé avec succès peuvent alors être facilement identifiées par sa coloration blanche par rapport aux cellules bleues non réussies.
D'autres gènes rapporteurs couramment utilisés sont la protéine fluorescente verte (GFP), qui produit des cellules qui brillent en vert sous une lumière bleue, et l'enzyme luciférase , qui catalyse une réaction avec la luciférine pour émettre de la lumière. L'ADN recombinant peut également être détecté en utilisant d'autres méthodes telles que l'hybridation d'acide nucléique avec une sonde d'ARN radioactif, tandis que les cellules qui ont exprimé la protéine souhaitée à partir du plasmide peuvent également être détectées en utilisant des méthodes immunologiques.
Les références
Liens externes
- Transformation bactérienne (une animation Flash)
- "Prêt, en joue, tirez!" À l'Institut Max Planck de physiologie moléculaire des plantes à Potsdam-Golm, les cellules végétales sont « bombardées » à l'aide d'un canon à particules