Transfert d'énergie de résonance Förster - Förster resonance energy transfer

Diagramme de Jablonski de FRET avec des échelles de temps typiques indiquées. Notez que la ligne pointillée noire indique un photon virtuel .

Förster ou transfert d'énergie par résonance de fluorescence ( FRET ), transfert d'énergie par résonance ( RET ) ou transfert d'énergie électronique ( EET ) est un mécanisme décrivant le transfert d'énergie entre deux molécules sensibles à la lumière ( chromophores ). Un chromophore donneur, initialement dans son état électronique excité, peut transférer de l'énergie à un chromophore accepteur par couplage dipôle-dipôle non radiatif . L'efficacité de ce transfert d'énergie est inversement proportionnelle à la puissance sixième de la distance entre le donneur et l'accepteur, ce qui rend FRET extrêmement sensible aux petits changements de distance.

Les mesures de l'efficacité du FRET peuvent être utilisées pour déterminer si deux fluorophores se trouvent à une certaine distance l'un de l'autre. Ces mesures sont utilisées comme outil de recherche dans des domaines tels que la biologie et la chimie.

Le FRET est analogue à la communication en champ proche, en ce que le rayon d'interaction est beaucoup plus petit que la longueur d' onde de la lumière émise. Dans la région du champ proche, le chromophore excité émet un photon virtuel qui est instantanément absorbé par un chromophore récepteur. Ces photons virtuels sont indétectables, car leur existence viole la conservation de l'énergie et de la quantité de mouvement, et donc FRET est connu comme un mécanisme sans rayonnement . Des calculs électrodynamiques quantiques ont été utilisés pour déterminer que le transfert d'énergie sans rayonnement (FRET) et radiatif sont les asymptotes à courte et longue portée d'un seul mécanisme unifié.

Terminologie

Diagramme de dessin animé du concept de transfert d'énergie de résonance de Förster (FRET).

Le transfert d'énergie par résonance de Förster est nommé d'après le scientifique allemand Theodor Förster . Lorsque les deux chromophores sont fluorescents, le terme « transfert d'énergie par résonance de fluorescence » est souvent utilisé à la place, bien que l'énergie ne soit pas réellement transférée par fluorescence . Afin d'éviter une interprétation erronée du phénomène qui est toujours un transfert d'énergie non radiatif (même lorsqu'il se produit entre deux chromophores fluorescents), le nom « transfert d'énergie de résonance de Förster » est préféré à « transfert d'énergie de résonance de fluorescence » ; cependant, ce dernier bénéficie d'un usage courant dans la littérature scientifique. Le FRET n'est pas limité à la fluorescence et se produit également en relation avec la phosphorescence.

Base théorique

L'efficacité FRET ( ) est le rendement quantique de la transition de transfert d'énergie, c'est-à-dire la probabilité qu'un événement de transfert d'énergie se produise par événement d'excitation du donneur : ${\style d'affichage E}$

${\displaystyle E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}},}$

où est le taux de transfert d'énergie, le taux de décroissance radiative du donneur et les taux de toute autre voie de désexcitation à l'exclusion des transferts d'énergie vers d'autres accepteurs. ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$${\style d'affichage k_{f}}$${\displaystyle k_{i}}$

L'efficacité du FRET dépend de nombreux paramètres physiques qui peuvent être regroupés comme : 1) la distance entre le donneur et l'accepteur (généralement dans la plage de 1 à 10 nm), 2) le chevauchement spectral du spectre d'émission du donneur et de l' absorption de l'accepteur spectre , et 3) l'orientation relative du moment dipolaire d' émission du donneur et du moment dipolaire d'absorption de l'accepteur.

${\style d'affichage E}$dépend de la distance de séparation donneur-accepteur avec une loi de puissance 6 inverse due au mécanisme de couplage dipôle-dipôle : ${\style d'affichage r}$

${\displaystyle E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}}$

avec étant la distance de Förster de ce couple donneur et accepteur, c'est-à-dire la distance à laquelle l'efficacité de transfert d'énergie est de 50%. La distance de Förster dépend de l' intégrale de chevauchement du spectre d'émission du donneur avec le spectre d'absorption de l'accepteur et de leur orientation moléculaire mutuelle telle qu'exprimée par l'équation suivante : ${\style d'affichage R_{0}}$

${\displaystyle {R_{0}}^{6}={\frac {2.07}{128\,\pi ^{5}\,N_{A}}}\,{\frac {\kappa ^{2} \,Q_{D}}{n^{4}}}{\int F_{\rm {D}}(\lambda )\,\epsilon _{\rm {A}}(\lambda )\,\lambda ^{4}\,d\lambda }}$

où est le rendement quantique de fluorescence du donneur en l'absence de l'accepteur, est le facteur d'orientation du dipôle, est l' indice de réfraction du milieu, est la constante d'Avogadro et est l'intégrale de chevauchement spectral calculée comme ${\displaystyle Q_{\text{D}}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\style d'affichage n}$${\displaystyle N_{\text{A}}}$${\style d'affichage J}$

${\displaystyle J={\frac {\int f_{\text{D}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda }{ \int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A }}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}$

où est le spectre d'émission du donneur, est le spectre d'émission du donneur normalisé à une zone de 1, et est le coefficient d'extinction molaire de l'accepteur , normalement obtenu à partir d'un spectre d'absorption. Le facteur d'orientation κ est donnée par ${\displaystyle f_{\text{D}}}$${\displaystyle {\overline {f_{\text{D}}}}}$${\displaystyle \epsilon _{\text{A}}}$

${\displaystyle \kappa ={\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {\mu }}_{\text{D}}-3({\hat {\mu } }_{\text{D}}\cdot {\hat {R}})({\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {R}}),}$

où désigne le moment dipolaire de transition normalisé du fluorophore respectif, et désigne le déplacement inter-fluorophore normalisé. = 2/3 est souvent supposé. Cette valeur est obtenue lorsque les deux colorants tournent librement et peuvent être considérés comme étant orientés de manière isotrope pendant la durée de vie de l'état excité. Si l'un des colorants est fixe ou n'est pas libre de tourner, alors = 2/3 ne sera pas une hypothèse valide. Dans la plupart des cas, cependant, même modeste réorientation des résultats des colorants en assez orientationnel moyenne que = 2/3 ne se traduit pas par une grande erreur dans la distance de transfert d'énergie estimée en raison de la dépendance sixième puissance de sur . Même lorsqu'il est assez différent de 2/3, l'erreur peut être associée à un décalage de , et donc les déterminations des changements de distance relative pour un système particulier sont toujours valables. Les protéines fluorescentes ne se réorientent pas sur une échelle de temps plus rapide que leur durée de vie de fluorescence. Dans ce cas 0 ≤ 4. ${\displaystyle {\hat {\mu }}_{i}}$${\displaystyle {\hat {R}}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\style d'affichage R_{0}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$${\style d'affichage R_{0}}$${\displaystyle \kappa ^{2}}$

Pour les analyses de FRET en fonction du temps, le taux de transfert d'énergie ( ) peut être utilisé directement à la place : ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$

${\displaystyle k_{\text{ET}}=({\frac {R_{0}}{r}})^{6}\,{\frac {1}{\tau _{D}}}}$

où est la durée de vie de fluorescence du donneur en l'absence de l'accepteur. ${\displaystyle \tau _{D}}$

L'efficacité du FRET concerne le rendement quantique et la durée de vie de fluorescence de la molécule donneuse comme suit :

${\displaystyle E=1-\tau '_{\text{D}}/\tau _{\text{D}},}$

où et sont les durées de vie de fluorescence du donneur en présence et en l'absence d'un accepteur respectivement, ou comme ${\displaystyle \tau _{\text{D}}'}$${\displaystyle \tau _{\text{D}}}$

${\displaystyle E=1-F_{\text{D}}'/F_{\text{D}},}$

où et sont les intensités de fluorescence du donneur avec et sans accepteur respectivement. ${\displaystyle F_{\text{D}}'}$${\displaystyle F_{\text{D}}}$

Confirmation expérimentale de la théorie du transfert d'énergie de résonance de Förster

La dépendance inverse de la distance de sixième puissance du transfert d'énergie de résonance de Förster a été confirmée expérimentalement par Wilchek , Edelhoch et Brand en utilisant des peptides tryptophyliques. Stryer , Haugland et Yguerabide ont également démontré expérimentalement la dépendance théorique du transfert d'énergie de résonance de Förster sur l'intégrale de chevauchement en utilisant un indolostéroïde fusionné comme donneur et une cétone comme accepteur. Cependant, beaucoup de contradictions d'expériences spéciales avec la théorie ont été observées. La raison en est que la théorie a un caractère approximatif et donne des distances surestimées de 50 à 100 ångströms.

Méthodes pour mesurer l'efficacité du FRET

En microscopie à fluorescence , à fluorescence confocale à balayage laser , ainsi qu'en biologie moléculaire , le FRET est un outil utile pour quantifier la dynamique moléculaire en biophysique et en biochimie , telle que les interactions protéine-protéine, les interactions protéine- ADN et les changements de conformation des protéines. Pour suivre la formation du complexe entre deux molécules, l'une d'entre elles est marquée avec un donneur et l'autre avec un accepteur. L'efficacité du FRET est mesurée et utilisée pour identifier les interactions entre les complexes marqués. Il existe plusieurs manières de mesurer l'efficacité du FRET en suivant l'évolution de la fluorescence émise par le donneur ou l'accepteur.

Émission sensibilisée

Une méthode de mesure de l'efficacité du FRET consiste à mesurer la variation de l'intensité d'émission de l'accepteur. Lorsque le donneur et l'accepteur sont à proximité (1-10 nm) en raison de l'interaction des deux molécules, l'émission de l'accepteur augmentera en raison du FRET intermoléculaire du donneur à l'accepteur. Pour surveiller les changements de conformation des protéines, la protéine cible est marquée avec un donneur et un accepteur à deux loci. Lorsqu'une torsion ou une courbure de la protéine entraîne un changement dans la distance ou l'orientation relative du donneur et de l'accepteur, un changement de FRET est observé. Si une interaction moléculaire ou un changement de conformation protéique dépend de la liaison du ligand , cette technique FRET est applicable aux indicateurs fluorescents pour la détection du ligand.

Photoblanchiment FRET

Les efficacités de FRET peuvent également être déduites des taux de photoblanchiment du donneur en présence et en l'absence d'un accepteur. Cette méthode peut être effectuée sur la plupart des microscopes à fluorescence ; on fait simplement briller la lumière d'excitation (d'une fréquence qui excitera le donneur mais pas l'accepteur de manière significative) sur des échantillons avec et sans le fluorophore accepteur et surveille la fluorescence du donneur (généralement séparée de la fluorescence de l'accepteur à l'aide d'un filtre passe-bande ) au fil du temps. L'échelle de temps est celle du photoblanchiment, qui va de quelques secondes à quelques minutes, la fluorescence dans chaque courbe étant donnée par

${\displaystyle {\text{background}}+{\text{constant}}\cdot e^{-{\text{time}}/\tau _{\text{pb}}},}$

où est la constante de temps de décroissance du photoblanchiment et dépend de la présence ou non de l'accepteur. Étant donné que le photoblanchiment consiste en l'inactivation permanente des fluorophores excités, le transfert d'énergie de résonance d'un donneur excité à un fluorophore accepteur empêche le photoblanchiment de ce fluorophore donneur, et donc une efficacité FRET élevée conduit à une constante de temps de décroissance du photoblanchiment plus longue : ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

${\displaystyle E=1-\tau _{\text{pb}}/\tau _{\text{pb}}',}$

où et sont les constantes de temps de décroissance du photoblanchiment du donneur en présence et en l'absence de l'accepteur respectivement. (Notez que la fraction est l'inverse de celle utilisée pour les mesures de durée de vie). ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}'}$${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

Cette technique a été introduite par Jovin en 1989. Son utilisation d'une courbe entière de points pour extraire les constantes de temps peut lui donner des avantages de précision par rapport aux autres méthodes. En outre, le fait que les mesures de temps soient sur des secondes plutôt que sur des nanosecondes le rend plus facile que les mesures de durée de vie de fluorescence, et parce que les taux de décroissance du photoblanchiment ne dépendent généralement pas de la concentration du donneur (à moins que la saturation de l'accepteur ne soit un problème), le contrôle minutieux des concentrations nécessaires pour l'intensité les mesures ne sont pas nécessaires. Il est cependant important de garder l'éclairement le même pour les mesures avec et sans accepteur, car le photoblanchiment augmente nettement avec une lumière incidente plus intense.

Mesures à vie

L'efficacité du FRET peut également être déterminée à partir du changement de la durée de vie de fluorescence du donneur. La durée de vie du donneur diminuera en présence de l'accepteur. Les mesures de durée de vie du donneur de FRET sont utilisées en microscopie d'imagerie à durée de vie en fluorescence (FLIM).

Fluorophores utilisés pour le FRET

Si le lieur est intact, l'excitation à la longueur d'onde d'absorbance de la CFP (414 nm) provoque l'émission par YFP (525 nm) en raison du FRET. Si le lieur est clivé par une protéase, le FRET est aboli et l'émission se fait à la longueur d'onde CFP (475 nm).

Paires CFP-YFP

Une paire commune de fluorophores à usage biologique est une paire de protéine fluorescente cyan (CFP) - protéine fluorescente jaune (YFP). Les deux sont des variantes de couleur de la protéine fluorescente verte (GFP). Le marquage avec des colorants fluorescents organiques nécessite une purification, une modification chimique et une injection intracellulaire d'une protéine hôte. Les variants de GFP peuvent être attachés à une protéine hôte par génie génétique, ce qui peut être plus pratique. De plus, une fusion de CFP et YFP ("tandem-dimer") liées par une séquence de clivage de protease peut être utilisée comme test de clivage.

BRET

Une limitation du FRET effectué avec des donneurs de fluorophore est la nécessité d'un éclairage externe pour initier le transfert de fluorescence, ce qui peut conduire à un bruit de fond dans les résultats de l'excitation directe de l'accepteur ou au photoblanchiment . Pour éviter cet inconvénient, le transfert d'énergie par résonance de bioluminescence (ou BRET ) a été développé. Cette technique utilise une luciférase bioluminescente (typiquement la luciférase de Renilla reniformis ) plutôt que la CFP pour produire une émission initiale de photons compatible avec YFP.

Le BRET a également été mis en œuvre à l'aide d'une enzyme luciférase différente, conçue à partir de la crevette des grands fonds Oplophorus gracilirostris . Cette luciférase est plus petite (19 kD) et plus brillante que la luciférase plus couramment utilisée de Renilla reniformis ., et a été nommée NanoLuc ou NanoKAZ. Promega a développé un substrat breveté pour NanoLuc appelé furimazine, bien que d'autres substrats précieux de coelenterazine pour NanoLuc aient également été publiés.

Homo-FRET

En général, "FRET" fait référence à des situations où les protéines donneuses et acceptrices (ou "fluorophores") sont de deux types différents. Dans de nombreuses situations biologiques, cependant, les chercheurs peuvent avoir besoin d'examiner les interactions entre deux ou plusieurs protéines du même type, voire la même protéine avec elle-même, par exemple si la protéine se replie ou fait partie d'une chaîne polymère de protéines ou pour d'autres questions de quantification dans les cellules biologiques.

De toute évidence, les différences spectrales ne seront pas l'outil utilisé pour détecter et mesurer le FRET, car la protéine acceptrice et la protéine donneuse émettent de la lumière avec les mêmes longueurs d'onde. Pourtant, les chercheurs peuvent détecter des différences de polarisation entre la lumière qui excite les fluorophores et la lumière qui est émise, dans une technique appelée imagerie par anisotropie FRET ; le niveau d'anisotropie quantifié (différence de polarisation entre les faisceaux d'excitation et d'émission) devient alors un guide indicatif du nombre d'événements FRET qui se sont produits.

Autres

Divers composés à côté des protéines fluorescentes.

Applications

Les applications du transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET) se sont considérablement développées au cours des 25 dernières années et la technique est devenue un incontournable dans de nombreux domaines biologiques et biophysiques . FRET peut être utilisé comme règle spectroscopique pour mesurer la distance et détecter les interactions moléculaires dans un certain nombre de systèmes et a des applications en biologie et en biochimie.

Protéines

Le FRET est souvent utilisé pour détecter et suivre les interactions entre les protéines. De plus, FRET peut être utilisé pour mesurer les distances entre les domaines dans une seule protéine en marquant différentes régions de la protéine avec des fluorophores et en mesurant l'émission pour déterminer la distance. Cela fournit des informations sur la conformation des protéines , y compris les structures secondaires et le repliement des protéines . Cela s'étend au suivi des changements fonctionnels dans la structure des protéines, tels que les changements de conformation associés à l' activité de la myosine . Appliqué in vivo, le FRET a été utilisé pour détecter l'emplacement et les interactions de structures cellulaires, y compris les intégrines et les protéines membranaires .

Membranes

Le FRET peut être utilisé pour observer la fluidité membranaire , le mouvement et la dispersion des protéines membranaires, les interactions lipide-protéine membranaire et protéine-protéine, et le mélange réussi de différentes membranes. Le FRET est également utilisé pour étudier la formation et les propriétés des domaines membranaires et des radeaux lipidiques dans les membranes cellulaires et pour déterminer la densité de surface dans les membranes.

Chimiosensoriel

Sonde à base de FRET qui s'active lors de l'interaction avec Cd2+

Les sondes basées sur FRET peuvent détecter la présence de diverses molécules : la structure de la sonde est affectée par la liaison ou l'activité de petites molécules, ce qui peut activer ou désactiver le système FRET. Ceci est souvent utilisé pour détecter les anions, les cations, les petites molécules non chargées et certaines biomacromolécules plus grosses. De même, les systèmes FRET ont été conçus pour détecter les changements dans l'environnement cellulaire dus à des facteurs tels que le pH , l' hypoxie ou le potentiel membranaire mitochondrial .

Voies de signalisation

Une autre utilisation du FRET est l'étude des voies métaboliques ou de signalisation . Par exemple, FRET et BRET ont été utilisés dans diverses expériences pour caractériser l' activation des récepteurs couplés aux protéines G et les mécanismes de signalisation qui en découlent. D'autres exemples incluent l'utilisation de FRET pour analyser des processus aussi divers que la chimiotaxie bactérienne et l' activité des caspases dans l' apoptose .

Autres applications

En plus des utilisations courantes mentionnées précédemment, le FRET et le BRET sont également efficaces dans l'étude de la cinétique des réactions biochimiques. Le FRET est de plus en plus utilisé pour surveiller l'assemblage et le désassemblage dépendant du pH et est précieux dans l'analyse des acides nucléiques . Cette technique peut être utilisée pour déterminer les facteurs affectant divers types de formation de nanoparticules ainsi que les mécanismes et les effets des nanomédicaments .

Autres méthodes

Un mécanisme différent, mais lié, est le transfert d'électrons de Dexter .

Une méthode alternative pour détecter la proximité protéine-protéine est la complémentation par fluorescence bimoléculaire (BiFC), où deux parties d'une protéine fluorescente sont chacune fusionnées à d'autres protéines. Lorsque ces deux parties se rencontrent, elles forment un fluorophore sur une échelle de temps de quelques minutes ou heures.

Voir également

• Transfert d'électrons de Dexter
• Accouplement Förster
• Transfert d'énergie de surface
• Transfert d'énergie de fluorescence résolu en temps

Les références

Liens externes

• Effet FRET dans un film mince sur YouTube
• FRET Imaging (Tutoriel de Becker & Hickl, site web)