Désoxyribozyme - Deoxyribozyme
Les désoxyribozymes , également appelés enzymes ADN , ADNzymes ou ADN catalytique , sont des oligonucléotides d' ADN capables d'effectuer une réaction chimique spécifique , souvent mais pas toujours catalytique . Ceci est similaire à l'action d'autres enzymes biologiques , telles que les protéines ou les ribozymes (enzymes composées d' ARN ). Cependant, contrairement à l'abondance d'enzymes protéiques dans les systèmes biologiques et à la découverte de ribozymes biologiques dans les années 1980, il n'y a que peu de preuves de désoxyribozymes naturels. Les désoxyribozymes ne doivent pas être confondus avec les aptamères d' ADN qui sont des oligonucléotides qui se lient sélectivement à un ligand cible , mais ne catalysent pas une réaction chimique ultérieure.
À l'exception des ribozymes, les molécules d'acide nucléique dans les cellules servent principalement de stockage d' informations génétiques en raison de leur capacité à former des paires de bases complémentaires , ce qui permet une copie et un transfert haute fidélité des informations génétiques. En revanche, les molécules d'acide nucléique sont plus limitées dans leur capacité catalytique, par rapport aux enzymes protéiques, à seulement trois types d'interactions : liaison hydrogène , empilement pi et coordination métal-ion . Cela est dû au nombre limité de groupes fonctionnels des monomères d'acide nucléique : alors que les protéines sont construites à partir de vingt acides aminés différents avec divers groupes fonctionnels, les acides nucléiques sont construits à partir de seulement quatre nucléobases chimiquement similaires . De plus, l'ADN est dépourvu du groupe 2'- hydroxyle présent dans l'ARN, ce qui limite la compétence catalytique des désoxyribozymes, même par rapport aux ribozymes.
En plus de l'infériorité inhérente de l'activité catalytique de l'ADN, le manque apparent de désoxyribozymes naturels peut également être dû à la conformation principalement double brin de l'ADN dans les systèmes biologiques, ce qui limiterait sa flexibilité physique et sa capacité à former des structures tertiaires . limiter considérablement la capacité de l'ADN double brin à agir comme catalyseur ; bien qu'il existe quelques exemples connus d'ADN simple brin biologique, tels que l'ADN simple brin multicopie (ADNms), certains génomes viraux et la fourche de réplication formée lors de la réplication de l'ADN. D'autres différences structurelles entre l'ADN et l'ARN peuvent également jouer un rôle dans l'absence de désoxyribozymes biologiques, tels que le groupe méthyle supplémentaire de la thymidine de base d'ADN par rapport à l' uracile de base d'ARN ou la tendance de l'ADN à adopter l' hélice de forme B tandis que l'ARN tend à adopter l' hélice A-forme . Cependant, il a également été montré que l'ADN peut former des structures que l'ARN ne peut pas, ce qui suggère que, bien qu'il existe des différences dans les structures que chacun peut former, aucune n'est intrinsèquement plus ou moins catalytique en raison de leurs motifs structuraux possibles.
Les types
Ribonucléases
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La classe la plus abondante de désoxyribozymes sont les ribonucléases , qui catalysent le clivage d'une liaison ribonucléotide phosphodiester par une réaction de transestérification , formant une extrémité phosphate 2'3'-cyclique et une extrémité 5'- hydroxyle . Les désoxyribozymes de ribonucléase subissent typiquement une sélection sous forme d'oligonucléotides longs à simple brin qui contiennent une seule base de ribonucléotide pour agir en tant que site de clivage. Une fois séquencée, cette forme "cis" monocaténaire du désoxyribozyme peut être convertie en la forme "trans" bicaténaire en séparant le domaine substrat (contenant le site de clivage du ribonucléotide) et le domaine enzymatique (contenant le noyau catalytique) en brins séparés qui peuvent s'hybrider à travers deux bras flanquants constitués de paires de bases complémentaires .
Le premier désoxyribozyme connu était une ribonucléase, découverte en 1994 par Ronald Breaker alors qu'il était stagiaire postdoctoral dans le laboratoire de Gerald Joyce au Scripps Research Institute . Ce désoxyribozyme, plus tard nommé GR-5, catalyse le clivage dépendant du Pb 2+ d'un seul ribonucléotide phosphoester à une vitesse plus de 100 fois supérieure à celle de la réaction non catalysée. Par la suite, d'autres désoxyribozymes clivant l'ARN qui incorporent différents cofacteurs métalliques ont été développés, notamment le désoxyribozyme E2 dépendant du Mg 2+ et le désoxyribozyme Mg5 dépendant du Ca 2+ . Ces premiers désoxyribozymes n'ont pas pu catalyser un brin de substrat d'ARN complet, mais en incorporant le brin de substrat d'ARN complet dans le processus de sélection, les désoxyribozymes qui fonctionnaient avec des substrats constitués d'ARN complet ou d'ADN complet avec une seule base d'ARN ont tous deux pu être utilisés . Les premiers de ces désoxyribozymes plus polyvalents, 8-17 et 10-23, sont actuellement les désoxyribozymes les plus étudiés. En fait, de nombreux désoxyribozymes découverts par la suite contiennent le même motif central catalytique que 8-17, y compris le Mg5 découvert précédemment, ce qui suggère que ce motif représente la « solution la plus simple pour le problème de clivage de l'ARN ». L'ADNzyme 10-23 contient un noyau catalytique de 15 nucléotides flanqué de deux domaines de reconnaissance de substrat. Cette DNAzyme clive efficacement les ARN complémentaires d'une manière spécifique à la séquence entre une purine non appariée et une pyrimidine appariée. Les DNAzymes ciblant AU ou GU contre GC ou AC sont plus efficaces. De plus, il a été démontré que les taux de clivage de l'ARN augmentent après l'introduction d'intercalants ou la substitution de la désoxyguanine par la désoxyinosine à la jonction de la boucle catalytique. Plus précisément, l'ajout de modifications 2'-0-méthyle au catalyseur s'est avéré augmenter de manière significative le taux de clivage à la fois in vitro et in vivo. D'autres désoxyribozymes ribonucléases notables sont celles qui sont hautement sélectives pour un certain cofacteur. Parmi ce groupe se trouvent les désoxyribozymes sélectifs des métaux tels que le 17E spécifique de Pb 2+ , le 39E spécifique de UO 2 2+ et le A43 spécifique de Na + . La première structure cristalline d'un DNAzyme a été rapportée en 2016. 10-23 DNAzymes à base de noyau et les MNAzymes respectifs qui catalysent les réactions à température ambiante ont été décrits en 2018 et ont ouvert des portes pour l'utilisation de ces enzymes à base d'acide nucléique pour de nombreuses autres applications sans avoir besoin de chauffage.
Ce lien et ce lien décrivent la molécule d'ADN 5'-GGAGAACGCGAGGCAAGGCTGGGAGAAATGTGGATCACGATT-3' , qui agit comme un désoxyribozyme qui utilise la lumière pour réparer un dimère de thymine , en utilisant la sérotonine comme cofacteur .
ARN ligases
Les ADN ligases sont particulièrement intéressantes . Ces molécules ont démontré une chimiosélectivité remarquable dans les réactions de ramification de l'ARN. Bien que chaque unité répétitive d'un brin d'ARN possède un groupe hydroxyle libre , l'ADN ligase n'en prend qu'un seul comme point de départ de la ramification. Cela ne peut pas être fait avec la chimie organique traditionnelle .
Autres réactions
De nombreux autres désoxyribozymes ont depuis été mis au point que la phosphorylation Catalyse de l' ADN, l' ADN adénylation , l' ADN déglycosylation , porphyrine métallation , thymine dimère photoreversion et le clivage d' ADN.
Méthodes
sélection in vitro
Comme il n'existe pas de désoxyribozymes naturels connus, la plupart des séquences de désoxyribozymes connues ont été découvertes grâce à une technique de sélection in vitro à haut débit , similaire à SELEX . la sélection in vitro utilise un « pool » d'un grand nombre de séquences d'ADN aléatoires (généralement 10 14 – 10 15 brins uniques) qui peuvent être criblées pour une activité catalytique spécifique. Le pool est synthétisé par synthèse en phase solide de telle sorte que chaque brin a deux régions constantes ( sites de liaison d' amorce pour l'amplification PCR) flanquant une région aléatoire d'une certaine longueur, généralement de 25 à 50 bases de long. Ainsi, le nombre total de brins uniques, appelé espace de séquence, est de 4 N où N désigne le nombre de bases dans la région aléatoire. Parce que 4 25 10 15 , il n'y a aucune raison pratique de choisir des régions aléatoires de moins de 25 bases de longueur, alors qu'aller au-dessus de ce nombre de bases signifie que l'espace de séquence total ne peut pas être étudié. Cependant, étant donné qu'il existe probablement de nombreux candidats potentiels pour une réaction catalytique donnée dans l'espace de séquence, des régions aléatoires de 50 et même plus ont produit avec succès des désoxyribozymes catalytiques.
Le pool est d'abord soumis à une étape de sélection, au cours de laquelle les brins catalytiques sont séparés des brins non catalytiques. La méthode de séparation exacte dépendra de la réaction catalysée. À titre d'exemple, l'étape de séparation pour le clivage des ribonucléotides utilise souvent la chromatographie d'affinité , dans laquelle une étiquette biologique attachée à chaque brin d'ADN est retirée de tous les brins catalytiquement actifs via le clivage d'une base ribonucléotidique. Cela permet aux brins catalytiques d'être séparés par une colonne qui lie spécifiquement le marqueur, puisque les brins non actifs resteront liés à la colonne tandis que les brins actifs (qui ne possèdent plus le marqueur) s'écoulent. Une configuration courante pour cela est une étiquette de biotine avec une colonne d'affinité pour la streptavidine . Une séparation basée sur l' électrophorèse sur gel peut également être utilisée dans laquelle le changement de poids moléculaire des brins lors de la réaction de clivage est suffisant pour provoquer un déplacement de l'emplacement des brins réactifs sur le gel. Après l'étape de sélection, le pool réactif est amplifié via une réaction en chaîne par polymérase (PCR) pour régénérer et amplifier les brins réactifs, et le processus est répété jusqu'à ce qu'un pool de réactivité suffisante soit obtenu. Plusieurs cycles de sélection sont nécessaires car certains brins non catalytiques passeront inévitablement par une seule étape de sélection. Habituellement, 4 à 10 tours sont nécessaires pour une activité catalytique sans ambiguïté, bien que plus de tours soient souvent nécessaires pour des conditions catalytiques plus strictes. Après un nombre suffisant de tours, le pool final est séquencé et les brins individuels sont testés pour leur activité catalytique. La dynamique du pool peut être décrite par la modélisation mathématique, qui montre comment les oligonucléotides subissent une liaison compétitive avec les cibles et comment le résultat évolutif peut être amélioré grâce à un réglage fin des paramètres.
Les désoxyribozymes obtenus par sélection in vitro seront optimisés pour les conditions lors de la sélection, telles que la concentration en sel , le pH et la présence de cofacteurs . Pour cette raison, l'activité catalytique uniquement en présence de cofacteurs spécifiques ou d'autres conditions peut être obtenue en utilisant des étapes de sélection positive, ainsi que des étapes de sélection négative contre d'autres conditions indésirables.
évolution in vitro
Une méthode similaire d'obtention de nouveaux désoxyribozymes est l' évolution in vitro . Bien que ce terme soit souvent utilisé de manière interchangeable avec la sélection in vitro, l' évolution in vitro se réfère de manière plus appropriée à une procédure légèrement différente dans laquelle le pool d'oligonucléotides initial est génétiquement modifié au cours des cycles suivants par recombinaison génétique ou par mutations ponctuelles . Pour les mutations ponctuelles, le pool peut être amplifié à l'aide d' une PCR sujette aux erreurs pour produire de nombreux brins différents de diverses mutations uniques aléatoires. Comme pour la sélection in vitro , les brins évolués avec une activité accrue auront tendance à dominer le pool après plusieurs étapes de sélection, et une fois qu'une activité catalytique suffisante est atteinte, le pool peut être séquencé pour identifier les brins les plus actifs.
Le pool initial pour l' évolution in vitro peut être dérivé d'un sous-ensemble restreint d'espace de séquence, tel qu'un certain cycle d'une expérience de sélection in vitro , qui est parfois aussi appelée resélection in vitro . Le pool initial peut également être dérivé de l'amplification d'un seul brin d'oligonucléotide. À titre d'exemple de ce dernier, une étude récente a montré qu'un désoxyribozyme fonctionnel peut être sélectionné par évolution in vitro d'un brin précurseur d'oligonucléotide non catalytique. Un fragment d'ADN arbitrairement choisi dérivé du transcrit d'ARNm de l'albumine de sérum bovin a été développé par des mutations ponctuelles aléatoires sur 25 cycles de sélection. Grâce à une analyse de séquençage en profondeur de diverses générations de pools, l'évolution du brin de désoxyribozyme le plus catalytique a pu être suivie à travers chaque mutation unique ultérieure. Cette première évolution réussie de l'ADN catalytique à partir d'un précurseur non catalytique pourrait soutenir l' hypothèse de l' ARN World . Dans une autre étude récente, un ribozyme d'ARN ligase a été converti en un désoxyribozyme par évolution in vitro du désoxyribo-analogue inactif du ribozyme. Le nouveau désoxyribozyme d'ARN ligase ne contenait que douze mutations ponctuelles, dont deux n'avaient aucun effet sur l'activité, et avait une efficacité catalytique d'environ 1/10 du ribozyme d'origine, bien que les recherches aient émis l'hypothèse que l'activité pourrait être encore augmentée grâce à une sélection plus poussée. Cette première preuve de transfert de fonction entre différents acides nucléiques pourrait soutenir diverses hypothèses du monde pré-ARN .
"Vraie" catalyse ?
Étant donné que la plupart des désoxyribozymes souffrent d'une inhibition du produit et présentent donc un comportement à renouvellement unique, il est parfois avancé que les désoxyribozymes ne présentent pas un comportement catalytique « vrai » car ils ne peuvent pas subir de catalyse à renouvellement multiple comme la plupart des enzymes biologiques . Cependant, la définition générale d'un catalyseur exige seulement que la substance accélère la vitesse d'une réaction chimique sans être consommée par la réaction (c'est-à-dire qu'elle n'est pas chimiquement modifiée de façon permanente et peut être recyclée). Ainsi, par cette définition, les désoxyribozymes à simple rotation sont bien des catalyseurs. En outre, de nombreuses enzymes endogènes ( protéines et ribozymes ) présentent également un comportement à rotation unique, et donc l'exclusion des désoxyribozymes du rang de "catalyseur" simplement parce qu'elle ne présente pas de comportement à rotation multiple semble injustifiée.
Applications
Bien que les enzymes ARN aient été découvertes avant les enzymes ADN, ces dernières présentent des avantages distincts. L'ADN est plus rentable et l'ADN peut être fabriqué avec une longueur de séquence plus longue et peut être fabriqué avec une pureté plus élevée dans la synthèse en phase solide . Plusieurs études ont montré l'utilisation d'ADNzymes pour inhiber la réplication des virus de la grippe A et B dans les cellules hôtes. Il a également été démontré que les DNAzymes inhibent la réplication du coronavirus du SRAS (SARS-CoV), du virus respiratoire syncytial (RSV), du rhinovirus humain 14 et du VHC
Essais cliniques de médicaments
L'asthme est caractérisé par une inflammation induite par les éosinophiles motivée par une cellule T auxiliaire de type 2 (Th2). En ciblant le facteur de transcription GATA3, de la voie Th2, avec DNAzyme, il peut être possible d'annuler l'inflammation. L'innocuité et l'efficacité de SB010, un nouvel ADNzyme 10-23, ont été évaluées et se sont révélées capables de cliver et d'inactiver l'ARN messager GATA3 dans les essais cliniques de phase IIa. Le traitement avec SB010 a compensé de manière significative les réponses asthmatiques tardives et précoces après une aggravation allergénique chez les patients masculins souffrant d'asthme allergique. Le facteur de transcription GATA-3 est également une cible intéressante, de la formulation topique DNAzyme SB012, pour une nouvelle stratégie thérapeutique dans la rectocolite hémorragique (CU). La RCH est une maladie intestinale inflammatoire idiopathique définie par des inflammations chroniques récurrentes du tractus gastro-intestinal, et caractérisée par une inflammation superficielle et continue des muqueuses, qui affecte principalement le gros intestin. Les patients qui ne répondent pas efficacement aux stratégies actuelles de traitement de la CU présentent de sérieux inconvénients, dont l'un peut conduire à une chirurgie colorectale et peut entraîner une qualité de vie gravement compromise. Ainsi, les patients atteints de CU modérée ou sévère peuvent bénéficier de manière significative de ces nouvelles alternatives thérapeutiques, dont SB012 est en essai clinique de phase I. La dermatite atopique (DA) est une affection cutanée inflammatoire chronique, dans laquelle les patients souffrent d'eczéma, de prurit souvent sévère sur la peau affectée, ainsi que de complications et d'infections secondaires. AD fait surface à partir d'une régulation à la hausse des réponses immunitaires modifiées par Th2, par conséquent, une nouvelle approche AD utilisant des ADNzymes ciblant GATA-3 est une option de traitement plausible. Le DNAzyme SB011 topique est actuellement en essais cliniques de phase II. La recherche DNAzyme pour le traitement du cancer est également en cours. Le développement d'un ADNzyme 10-23 qui peut bloquer l'expression de l'IGF-I (facteur de croissance I analogue à l'insuline, un contributeur à la croissance cellulaire normale ainsi qu'à la tumorigenèse) en ciblant son ARNm pourrait être utile pour bloquer la sécrétion d'IGF- I des cellules primaires de la tempête de la prostate inhibant finalement le développement de la tumeur de la prostate. De plus, avec ce traitement, on s'attend à ce que les métastases hépatiques soient également inhibées, via l'inhibition de l'IGF-I dans le foie (la principale source d'IGF-I sérique).
Capteurs
Les ADNzymes ont trouvé une utilisation pratique dans les biocapteurs métalliques. Un biocapteur basé sur DNAzyme pour l'ion plomb a été utilisé pour détecter l'ion plomb dans l'eau dans les écoles publiques de St. Paul au Minnesota. De plus, les ADNzymes ont été utilisées en combinaison d'aptamères et de biorécepteurs d'acide nucléique pour le développement d'un essai biologique multiplex.
Synthèse asymétrique
La chiralité est une autre propriété qu'un DNAzyme peut exploiter. L'ADN se présente dans la nature sous la forme d'une double hélice droite et dans la synthèse asymétrique, un catalyseur chiral est un outil précieux dans la synthèse de molécules chirales à partir d'une source achirale. Dans une application, un catalyseur d'ADN artificiel a été préparé en y attachant un ion cuivre à travers un espaceur. Le complexe cuivre-ADN a catalysé une réaction de Diels-Alder dans l'eau entre le cyclopentadiène et une aza chalcone. Les produits de réaction (endo et exo) se sont avérés être présents en un excès énantiomérique de 50 %. Plus tard, il a été découvert qu'un excès énantiomérique de 99% pouvait être induit, et que le taux et l'énantiosélectivité étaient liés à la séquence d'ADN.
Autres utilisations
D'autres utilisations de l'ADN en chimie sont la synthèse de modèles d'ADN , la catalyse énantiosélective, les nanofils d' ADN et le calcul de l'ADN .
Voir également
Les références
Liens externes
- Désoxyribozyme à la National Library of Medicine Medical Subject Headings (MeSH) des États-Unis