La radioactivité dans les sciences de la vie - Radioactivity in the life sciences
La radioactivité est généralement utilisée en sciences de la vie pour des mesures très sensibles et directes de phénomènes biologiques, et pour visualiser la localisation de biomolécules radiomarquées avec un radio - isotope .
Tous les atomes existent sous forme d' isotopes stables ou instables et ces derniers se désintègrent à une demi-vie donnée allant de l'attoseconde à des milliards d'années ; les radio-isotopes utiles aux systèmes biologiques et expérimentaux ont des demi-vies allant de quelques minutes à plusieurs mois. Dans le cas de l'isotope de l'hydrogène tritium (demi-vie = 12,3 ans) et du carbone 14 (demi-vie = 5 730 ans), ces isotopes tirent leur importance de toute vie organique contenant de l'hydrogène et du carbone et peuvent donc être utilisés pour étudier d'innombrables processus, réactions et phénomènes vivants. La plupart des isotopes à courte durée de vie sont produits dans des cyclotrons , des accélérateurs linéaires de particules ou des réacteurs nucléaires et leurs demi-vies relativement courtes leur confèrent des activités spécifiques théoriques maximales élevées, utiles pour la détection dans les systèmes biologiques.
Le radiomarquage est une technique utilisée pour suivre le passage d'une molécule qui incorpore un radio-isotope à travers une réaction, une voie métabolique, une cellule, un tissu, un organisme ou un système biologique. Le réactif est "marqué" en remplaçant des atomes spécifiques par leur isotope. Le remplacement d'un atome par son propre radio-isotope est un marqueur intrinsèque qui n'altère pas la structure de la molécule. Alternativement, les molécules peuvent être radiomarquées par des réactions chimiques qui introduisent un atome, une fraction ou un groupe fonctionnel qui contient un radionucléide . Par exemple, la radio-iodation de peptides et de protéines avec des isotopes d'iode biologiquement utiles est facilement réalisée par une réaction d'oxydation qui remplace le groupe hydroxyle par de l'iode sur les résidus tyrosine et histadine . Un autre exemple consiste à utiliser des chélateurs tels le DOTA qui peuvent être couplés chimiquement à une protéine ; le chélateur piège à son tour les radiométaux, radiomarquant ainsi la protéine. Celui-ci a été utilisé pour introduire de l'Yttrium-90 sur un anticorps monoclonal à des fins thérapeutiques et pour introduire du Gallium-68 sur le peptide Octréotide pour l'imagerie diagnostique par imagerie TEP . (Voir DOTA utilise .)
Le radiomarquage n'est pas nécessaire pour certaines applications. À certaines fins, les sels ioniques solubles peuvent être utilisés directement sans autre modification (par exemple, le gallium-67 , le gallium-68 et les isotopes de l' iode radioactif). Ces utilisations reposent sur les propriétés chimiques et biologiques du radio-isotope lui-même, pour le localiser au sein de l'organisme ou du système biologique.
L'imagerie moléculaire est le domaine biomédical qui utilise des radiotraceurs pour visualiser et quantifier les processus biologiques à l'aide de la tomographie par émission de positons (TEP) et de la tomographie par émission monophotonique (SPECT). Encore une fois, une caractéristique clé de l'utilisation de la radioactivité dans les applications des sciences de la vie est qu'il s'agit d'une technique quantitative, de sorte que la TEP/SPECT révèle non seulement où se trouve une molécule radiomarquée, mais aussi sa quantité.
La radiobiologie (également connue sous le nom de radiobiologie ) est un domaine des sciences médicales cliniques et fondamentales qui implique l'étude de l'action de la radioactivité sur les systèmes biologiques. L'action contrôlée de la radioactivité délétère sur les organismes vivants est à la base de la radiothérapie .
Exemples de radionucléides biologiquement utiles
Hydrogène
Le tritium (hydrogène-3) est un émetteur d'énergie bêta très faible qui peut être utilisé pour marquer des protéines , des acides nucléiques , des médicaments et presque toutes les biomolécules organiques. L'activité spécifique théorique maximale du tritium est de 28,8 kCi / mol (1 070 TBq /mol). Cependant, il y a souvent plus d'un atome de tritium par molécule : par exemple, l' UTP tritié est vendu par la plupart des fournisseurs avec les carbones 5 et 6 liés chacun à un atome de tritium.
Pour la détection du tritium, des compteurs à scintillation liquide ont été classiquement utilisés, dans lesquels l'énergie d'une décroissance du tritium est transférée à une molécule scintillante en solution qui à son tour émet des photons dont l'intensité et le spectre peuvent être mesurés par un réseau photomultiplicateur . L'efficacité de ce procédé est de 4 à 50 %, selon le cocktail de scintillation utilisé. Les mesures sont généralement exprimées en coups par minute (CPM) ou en désintégrations par minute (DPM). Alternativement, un écran au phosphore spécifique au tritium à l'état solide peut être utilisé avec un phosphorimageur pour mesurer et imager simultanément le radiotraceur. Les mesures/images sont de nature numérique et peuvent être exprimées en unités d'intensité ou de densitométrie dans une région d'intérêt (ROI).
Carbone
Le carbone 14 a une longue demi-vie de5730 ± 40 ans . Son activité spécifique maximale est de 0,0624 kCi/mol (2,31 TBq/mol). Il est utilisé dans des applications telles que la datation radiométrique ou les tests de dépistage de drogue. Le marquage au carbone 14 est courant dans le développement de médicaments pour effectuer des études ADME (absorption, distribution, métabolisme et excrétion) dans des modèles animaux et dans des essais de toxicologie humaine et cliniques. Étant donné que l'échange de tritium peut se produire dans certains composés radiomarqués, cela ne se produit pas avec le carbone-14 et peut donc être préféré.
Sodium
Le sodium-22 et le chlore-36 sont couramment utilisés pour étudier les transporteurs d'ions . Cependant, le sodium-22 est difficile à filtrer et le chlore-36, avec une demi-vie de 300 000 ans, a une faible activité.
Soufre
Le soufre-35 est utilisé pour marquer les protéines et les acides nucléiques. La cystéine est un acide aminé contenant un groupe thiol qui peut être marqué par le soufre-35. Pour les nucléotides qui ne contiennent pas de groupe soufre, l'oxygène sur l'un des groupes phosphate peut être substitué par un soufre. Ce thiophosphate agit de la même manière qu'un groupe phosphate normal, bien qu'il y ait un léger biais contre lui par la plupart des polymérases . L'activité spécifique théorique maximale est de 1 494 kCi/mol (55,3 PBq/mol).
Phosphore
Le phosphore-32 est largement utilisé pour marquer les acides nucléiques et les phosphoprotéines. Il a l'énergie d'émission la plus élevée (1,7 MeV) de tous les radio-isotopes de recherche courants. Il s'agit d'un avantage majeur dans les expériences pour lesquelles la sensibilité est une considération primordiale, telles que les titrages d'interactions très fortes ( c'est -à- dire , constante de dissociation très faible ), les expériences d'empreinte et la détection d'espèces phosphorylées à faible abondance. Le phosphore-32 est également relativement peu coûteux. En raison de sa haute énergie, cependant, son utilisation sûre nécessite un certain nombre de contrôles techniques ( par exemple , le verre acrylique ) et de contrôles administratifs . La demi-vie du phosphore-32 est de 14,2 jours et son activité spécifique maximale est de 9 131 kCi/mol (337,8 PBq/mol).
Le phosphore-33 est utilisé pour marquer les nucléotides. Il est moins énergétique que le phosphore-32 et ne nécessite pas de protection avec du plexiglas . Un inconvénient est son coût plus élevé par rapport au phosphore-32, car la plupart du phosphore-31 bombardé n'aura acquis qu'un seul neutron , tandis que certains seulement en auront acquis deux ou plus. Son activité spécifique maximale est de 5 118 kCi/mol (189,4 PBq/mol).
Iode
L'iode 125 est couramment utilisé pour marquer les protéines, généralement au niveau des résidus tyrosine. L'iode non lié est volatil et doit être manipulé sous une hotte. Son activité spécifique maximale est de 2 176 kCi/mol (80,5 PBq/mol).
Un bon exemple de la différence d'énergie des différents radionoyaux est la plage des fenêtres de détection utilisées pour les détecter, qui sont généralement proportionnelles à l'énergie de l'émission, mais varient d'une machine à l'autre : dans un compteur à scintillation Perkin elmer TriLux Beta, le la fenêtre de plage d'énergie de l'hydrogène-3 se situe entre les canaux 5 et 360 ; le carbone-14, le soufre-35 et le phosphore-33 sont dans la fenêtre de 361-660 ; et le phosphore-32 est dans la fenêtre de 661-1024.
Détection
Quantitatif
Dans le comptage à scintillation liquide , une petite aliquote, un filtre ou un écouvillon est ajouté au fluide de scintillation et la plaque ou le flacon est placé dans un compteur à scintillation pour mesurer les émissions radioactives. Les fabricants ont incorporé des scintillants solides dans des plaques multipuits pour éliminer le besoin de fluide de scintillation et en faire une technique à haut débit.
Un compteur gamma est de format similaire au comptage à scintillation mais il détecte directement les émissions gamma et ne nécessite pas de scintillant.
Un compteur Geiger est une approximation rapide et grossière de l'activité. Les émetteurs de faible énergie tels que le tritium ne peuvent pas être détectés.
Qualitatif et quantitatif
Autoradiographie : Une coupe de tissu apposée sur une lame de microscope ou une membrane telle qu'un Northern blot ou un slot blot hybridé peut être placée contre un film radiographique ou des écrans phosphorescents pour acquérir une image photographique ou numérique. La densité d'exposition, si elle est calibrée, peut fournir des informations quantitatives précises.
Écran de stockage de phosphore : La lame ou la membrane est placée contre un écran de phosphore qui est ensuite balayé dans un phosphorimager . C'est beaucoup plus rapide que les techniques de film/émulsion et produit des données sous forme numérique, ainsi il a largement remplacé les techniques de film/émulsion.
Microscopie
Microscopie électronique : L'échantillon n'est pas exposé à un faisceau d'électrons mais des détecteurs captent les électrons expulsés des radionoyaux.
Micro-autoradiographie : Une coupe de tissu, typiquement cryosectionnée, est placée contre un écran phosphorescent comme ci-dessus.
Autoradiographie quantitative du corps entier (QWBA) : plus grandes que la micro-autoradiographie, les animaux entiers, généralement des rongeurs, peuvent être analysés pour des études de biodistribution.
Méthodes scientifiques
La régression de Schild est un test de liaison de radioligand. Il est utilisé pour le marquage de l'ADN (5' et 3'), laissant les acides nucléiques intacts.
Concentration de radioactivité
Un flacon de radiomarqueur a une "activité totale". En prenant comme exemple γ32P ATP , des catalogues des deux principaux fournisseurs, Perkin Elmer NEG502H500UC ou GE AA0068-500UCI, dans ce cas, l'activité totale est de 500 μCi (les autres nombres typiques sont 250 μCi ou 1 mCi). Celui-ci est contenu dans un certain volume, en fonction de la concentration radioactive, tel que 5 à 10 mCi/mL (185 à 370 TBq/m 3 ) ; les volumes typiques incluent 50 ou 25 L.
Toutes les molécules de la solution n'ont pas de P-32 sur le dernier phosphate (c'est-à-dire le gamma) : l'« activité spécifique » donne la concentration de radioactivité et dépend de la demi-vie des radionoyaux. Si chaque molécule était marquée, on obtient l'activité spécifique théorique maximale qui pour le P-32 est de 9131 Ci/mmol. En raison de problèmes de pré-étalonnage et d'efficacité, ce numéro n'apparaît jamais sur une étiquette ; les valeurs souvent rencontrées sont 800, 3000 et 6000 Ci/mmol. Avec ce nombre, il est possible de calculer la concentration chimique totale et le rapport chaud/froid.
La « date d'étalonnage » est la date à laquelle l'activité du flacon est la même que sur l'étiquette. Le « pré-étalonnage » est lorsque l'activité est étalonnée à une date future pour compenser la dégradation survenue pendant l'expédition.
Comparaison avec la fluorescence
Avant l'utilisation généralisée de la fluorescence au cours des trois dernières décennies, la radioactivité était le marqueur le plus courant.
Le principal avantage de la fluorescence par rapport aux radiotraceurs est qu'elle ne nécessite pas de contrôles radiologiques et leurs dépenses et mesures de sécurité associées. La désintégration des radio-isotopes peut limiter la durée de conservation d'un réactif, nécessitant son remplacement et augmentant ainsi les dépenses. Plusieurs molécules fluorescentes peuvent être utilisées simultanément (étant donné qu'elles ne se chevauchent pas, cf. FRET), alors qu'avec la radioactivité deux isotopes peuvent être utilisés (le tritium et un isotope de basse énergie, par exemple le 33 P en raison d'intensités différentes) mais nécessitent un équipement particulier (un un écran au tritium et un écran ordinaire d'imagerie au phosphore, un détecteur spécifique à double canal, par exemple [1] ).
La fluorescence n'est pas nécessairement plus facile ou plus pratique à utiliser car la fluorescence nécessite son propre équipement spécialisé et parce que l' extinction rend difficile la quantification absolue et/ou reproductible.
Le principal inconvénient de la fluorescence par rapport aux radiotraceurs est un problème biologique important : le marquage chimique d'une molécule avec un colorant fluorescent change radicalement la structure de la molécule, ce qui peut à son tour changer radicalement la façon dont cette molécule interagit avec d'autres molécules. En revanche, le radiomarquage intrinsèque d'une molécule peut être effectué sans altérer sa structure de quelque manière que ce soit. Par exemple, substituer un H-3 à un atome d'hydrogène ou C-14 à un atome de carbone ne change pas la conformation, la structure ou toute autre propriété de la molécule, c'est juste un changement de forme du même atome. Ainsi, une molécule intrinsèquement radiomarquée est identique à sa contrepartie non marquée.
La mesure des phénomènes biologiques par les radiotraceurs est toujours directe. En revanche, de nombreuses applications de fluorescence en sciences de la vie sont indirectes, consistant en un colorant fluorescent augmentant, diminuant ou changeant l'émission de longueur d'onde lors de la liaison à la molécule d'intérêt.
Sécurité
Si de bons contrôles de santé physique sont maintenus dans un laboratoire où des radionucléides sont utilisés, il est peu probable que la dose globale de rayonnement reçue par les travailleurs soit d'une grande importance. Néanmoins, les effets des faibles doses sont pour la plupart inconnus donc de nombreuses réglementations existent pour éviter les risques inutiles, tels que l'exposition cutanée ou interne. En raison du faible pouvoir de pénétration et des nombreuses variables impliquées, il est difficile de convertir une concentration radioactive en dose. 1 µCi de P-32 sur un centimètre carré de peau (à travers une couche morte d'une épaisseur de 70 µm) donne 7961 rads (79,61 grays ) par heure. De même, une mammographie donne une exposition de 300 mrem (3 mSv ) sur un volume plus important (aux États-Unis, la dose annuelle moyenne est de 620 mrem ou 6,2 mSv ).