Ingénierie cofacteur - Cofactor engineering

L'ingénierie des cofacteurs , un sous-ensemble de l'ingénierie métabolique , est définie comme la manipulation de l'utilisation de cofacteurs dans les voies métaboliques d' un organisme . Dans l'ingénierie des cofacteurs, les concentrations de cofacteurs sont modifiées afin de maximiser ou de minimiser les flux métaboliques. Ce type d'ingénierie peut être utilisé pour optimiser la production d'un produit métabolite ou pour augmenter l'efficacité d'un réseau métabolique . L'utilisation de l'ingénierie d'organismes unicellulaires pour créer des produits chimiques lucratifs à partir de matières premières bon marché se développe, et l'ingénierie des cofacteurs peut jouer un rôle crucial dans la maximisation de la production. Le domaine a gagné en popularité au cours de la dernière décennie et a plusieurs applications pratiques dans la fabrication de produits chimiques, la bio-ingénierie et les industries pharmaceutiques.

Les cofacteurs sont des composés non protéiques qui se lient aux protéines et sont nécessaires à la fonctionnalité catalytique normale des protéines . Les cofacteurs peuvent être considérés comme des « molécules auxiliaires » dans l'activité biologique et affectent souvent la fonctionnalité des enzymes. Les cofacteurs peuvent être à la fois des composés organiques et inorganiques. Quelques exemples de cofacteurs inorganiques sont le fer ou le magnésium, et des exemples de cofacteurs organiques comprennent l' ATP ou coenzyme A . Les cofacteurs organiques sont plus spécifiquement connus sous le nom de coenzymes , et de nombreuses enzymes nécessitent l'ajout de coenzymes pour assumer une fonction catalytique normale dans une réaction métabolique. Les coenzymes se lient au site actif d'une enzyme pour favoriser la catalyse. En créant des cofacteurs et des coenzymes, une réaction métabolique naturelle peut être manipulée pour optimiser le rendement d'un réseau métabolique.

Fond

Les cofacteurs ont été découverts par Arthur Harden et William Young en 1906, lorsqu'ils ont découvert que le taux de fermentation alcoolique dans les extraits de levure non bouillis augmentait lorsque l'extrait de levure bouilli était ajouté. Quelques années plus tard, Hans von Euler-Chelpin a identifié le cofacteur dans l'extrait bouilli comme étant le NAD ⁺ . D'autres cofacteurs, tels que l' ATP et la coenzyme A, ont été découverts plus tard dans les années 1900. Le mécanisme de l' activité du cofacteur a été découvert lorsque Otto Heinrich Warburg a déterminé en 1936 que le NAD ⁺ fonctionnait comme un accepteur d'électrons . Bien après ces premières découvertes, les scientifiques ont commencé à se rendre compte que la manipulation des concentrations de cofacteur pouvait être utilisée comme outils pour l'amélioration des voies métaboliques .

Un groupe important de cofacteurs organiques est la famille de molécules appelées vitamines . La vitamine B12 (cobalamine), par exemple, joue un rôle crucial dans le corps humain, tandis que la coenzyme B12 , son dérivé, se trouve dans le métabolisme de chaque type de cellule de notre corps. Sa présence affecte la synthèse et la régulation de l' ADN cellulaire ainsi qu'elle participe à la synthèse des acides gras et à la production d'énergie. Les cofacteurs sont requis par de nombreuses voies métaboliques importantes , et il est possible que les concentrations d'un seul type de cofacteur affectent les flux de nombreuses voies différentes.

Les minéraux et les ions métalliques que les organismes absorbent par le biais de leur alimentation constituent d'excellents exemples de cofacteurs inorganiques . Par exemple, le Zn ²⁺ est nécessaire pour aider l' enzyme anhydrase carbonique car elle convertit le dioxyde de carbone et l'eau en bicarbonate et en protons. Un minéral largement reconnu qui agit comme cofacteur est le fer, qui est essentiel au bon fonctionnement de l' hémoglobine , la protéine de transport de l'oxygène présente dans les globules rouges . Cet exemple met particulièrement en évidence l'importance des cofacteurs dans le métabolisme animal .

Importance

L'ingénierie des cofacteurs est importante dans la manipulation des voies métaboliques . Une voie métabolique est une série de réactions chimiques qui se produisent dans un organisme. L'ingénierie métabolique a pour objet de modifier les flux au sein d'une voie métabolique. En génie métabolique, une voie métabolique peut être directement modifiée en modifiant la fonctionnalité des enzymes impliquées dans la voie. L'ingénierie des cofacteurs offre une approche distincte et certains avantages pour modifier une voie métabolique. Au lieu de changer les enzymes utilisées dans une voie, les cofacteurs peuvent être modifiés. Cela peut donner aux ingénieurs métaboliques un avantage en raison de certaines propriétés des cofacteurs et de la manière dont ils peuvent être modifiés.

Les voies métaboliques peuvent être utilisées par les ingénieurs métaboliques pour créer un produit souhaité. En modifiant les types de cofacteurs utilisés et les moments auxquels ils sont utilisés, le résultat du réseau métabolique peut changer. Pour créer une plus grande production d'un produit, les ingénieurs métaboliques ont la capacité de fournir au réseau le cofacteur le mieux adapté à ce processus spécifique. Cela conduit à l'optimisation des réseaux pour donner une production plus élevée des produits souhaités. De plus, changer les cofacteurs utilisés dans un réseau peut être une solution ingénieuse à un problème compliqué. Un réseau présent dans la cellule, mais souvent inutilisé, peut avoir un produit souhaitable. Au lieu de concevoir un tout nouvel ensemble de voies pour produire le produit, l'ingénierie des cofacteurs peut être appliquée. En remplaçant les enzymes pour utiliser des cofacteurs facilement disponibles dans une cellule, le réseau généralement inutilisé n'est plus limité par les cofacteurs et la production peut être augmentée.

En plus de modifier le rendement des réseaux métaboliques, la modification des cofacteurs utilisés dans un réseau peut réduire les coûts d'exploitation lors de la tentative de formation d'un produit souhaité. Le NADH et le NADPH sont deux cofacteurs cellulaires extrêmement courants, ne différant que par la présence d'un groupe phosphate. Cependant, ce groupement phosphate rend le NADPH beaucoup moins stable que le NADH, et donc plus coûteux à synthétiser. Ainsi, il est avantageux d'essayer d'utiliser le NADH sur certains réseaux cellulaires, car il est souvent moins cher, plus facilement disponible et accomplit la même tâche que le NADPH.

Outils et processus

L'ingénierie des cofacteurs concerne le plus souvent la manipulation de micro - organismes tels que Saccharomyces cerevisiae et Escherichia coli , et en tant que telle nécessite l'utilisation de techniques d'ADN recombinant . Ces techniques utilisent de petits segments circulaires d' ADN appelés plasmides , qui peuvent être introduits et incorporés par des micro-organismes tels que Escherichia coli . Ces plasmides sont spécifiquement conçus en laboratoire pour être facilement incorporés et affectent l'expression de diverses protéines , métabolites et enzymes . Par exemple, un plasmide particulier peut provoquer un changement dans la séquence d' acides aminés d' une enzyme , ce qui pourrait augmenter son affinité pour un substrat particulier .

Les micro-organismes ont besoin d'un milieu pour se développer, et l'un d'entre eux couramment utilisé pour les cultures d' Escherichia coli est le bouillon Luria-Bertani (LB). Ce milieu est souvent complété avec du glucose et contiendra souvent des molécules supplémentaires conçues pour faciliter une croissance optimale de la culture. Les pré-cultures peuvent ensuite être cultivées dans des flacons agités. Ce sont simplement des fioles Erlenmeyer bouchées qui sont laissées sur une machine à agiter orbitale, qui tourne à très haut régime . Ce processus aère la culture, ce qui est nécessaire pour une croissance optimale. Une fois les pré-cultures prêtes, les plasmides nécessaires à des expériences spécifiques sont ajoutés à chaque culture séparément, puis chaque culture est transférée dans un bio-réacteur. Les bioréacteurs sont des systèmes qui permettent aux cultures de se développer dans un environnement contrôlé. Cela laisse les plasmides introduits comme seule variable indépendante. La température, le pH , les concentrations de métabolites et divers autres facteurs environnementaux requis peuvent être maintenus par le bioréacteur, garantissant des conditions de croissance identiques pour chaque culture.

Une fois que les échantillons sont autorisés à se développer dans le réacteur pendant une période spécifiée, ils peuvent être retirés et étudiés pour déterminer si les altérations prévues pour l'organisme sont évidentes. Étant donné que l'ingénierie des cofacteurs traite le plus souvent des voies métaboliques , ces organismes sont souvent étudiés mais en introduisant des métabolites fluorescents marqués spécifiques et en documentant leur progression à travers diverses voies. Dans d'autres cas, les résultats sont plus évidents et facilement observables, comme avec la diminution de la production d' éthanol de la levure mentionnée ci-dessous.

Applications

Changer le cofacteur d'une enzyme de NADPH en NADH

Les biocatalyseurs sont nécessaires à la production de blocs de construction chiraux nécessaires dans les produits pharmaceutiques et autres produits chimiques utilisés par la société. Beaucoup de ces biocatalyseurs nécessitent le NADPH comme cofacteur . Le NADPH, un cofacteur assez similaire au NADH, est à la fois plus cher et moins stable que son homologue NADH . Pour ces raisons, les fabricants préféreraient que les biocatalyseurs qu'ils utilisent dans leurs lignes de production acceptent le NADH plutôt que le NADPH. L'ingénierie des cofacteurs a récemment réussi à modifier les enzymes pour préférer le NADH comme cofacteur au lieu du NADPH. En 2010, un groupe de scientifiques a réalisé une ingénierie cofacteur sur l' enzyme Gre2p, une déshydrogénase préférant le NADPH trouvée dans Saccharomyces cerevisiae . Gre2p réduit le composé dicétone 2,5-hexanedione en blocs de construction chiraux (5S)-hydroxy-2-hexanone et (2S,5S)-hexanediol. Les scientifiques ont déterminé que Asn9 ( Asparagine , position 9) était un acide aminé important le site actif de Gre2p. Plus précisément, Asn9 se lie au groupe 3'-hydroxyle et à l'atome 2'-oxygène de la fraction adénylribose . Par mutagenèse directe , les scientifiques ont échangé l'Asn9 contre l'Asp ( acide aspartique ) et le Glu ( acide glutamique ). Ce changement a entraîné une diminution de la dépendance de Gre2p vis-à-vis du NADPH et une affinité accrue pour le NADH. Cela a entraîné une augmentation de l'activité Gre2p lors de l'utilisation du NADH. Il a été observé que la substitution d'Asn9 par Glu produisait un effet plus important que le changement d'Asn9 en Asp. Asn contient une chaîne latérale non chargée polaire, tandis que Asp et Glu contiennent une chaîne latérale chargée polaire. L'effet accru de Glu est causé par le carbone supplémentaire dans sa chaîne latérale qui le rapproche de la fraction adényl ribose. Cela permet une liaison hydrogène plus forte entre les groupes hydroxyle 2'- et 3'-ribose et le groupe carboxyle de la chaîne latérale . La vitesse maximale de la réaction a doublé, lors de l'utilisation du NADH, lorsque Asn9 a été remplacé par Glu. Avec ces résultats, les scientifiques ont réussi à concevoir Gre2p pour préférer le NADH au NADPH et ont augmenté la vitesse de réduction de la 2,5-hexanedione. Cela permettra aux entreprises chimiques de réduire leurs coûts de fabrication en utilisant du NADH au lieu du NADPH au moins pour cette réduction particulière.

Modification de la préférence de cofacteur d'un réseau

Un autre exemple de modification de la préférence d'une enzyme pour les cofacteurs consiste à modifier la réaction dépendante du NADH en des réactions dépendantes du NADPH. Dans cet exemple, les enzymes elles-mêmes ne sont pas modifiées, mais différentes enzymes sont sélectionnées pour accomplir la même réaction avec l'utilisation d'un cofacteur différent. Une voie modifiée a été créée pour fabriquer du 1-butanol à partir d' acétyl-CoA en modifiant les enzymes de la voie métabolique de S. elongatus . Le genre Clostridium est connu pour produire du 1-butanol, fournissant une voie qui pourrait être insérée dans S. elongatus. Cette voie synthétise le 1-butanol en utilisant la voie inverse de la β-oxydation. Les enzymes impliquées dans cette voie nouvellement conçue étaient spécifiques du NADH, ce qui était problématique pour la réplication de la voie dans S. elongatus car les cyanobactéries produisent beaucoup plus de NADPH que de NADH.

Le groupe de recherche a ensuite identifié des enzymes qui utilisent le NADPH ou à la fois le NADPH et le NADH par bioprospection . L'acétoacétyl-CoA réductase (PhaB) s'est avérée être un remplacement approprié pour la déshydrogénase hydroxybutyrique (Hbd). Pour remplacer AdhE2, les chercheurs ont découvert que l'alcool déshydrogénase dépendante du NADP (YqhD) d'E. coli était efficace pour la voie. De plus, les chercheurs avaient besoin d'une déshydrogénase pour remplacer la capacité d'aldéhyde déshydrogénase d'AdhE2. La butyraldéhyde déshydrogénase (Bldh) acylante de la CoA de C. saccharoperbutylacetonicum s'est avérée être une bonne solution. Ensemble, PhaB, Bldh, YqhD peuvent remplacer Hbd et AdhE2, respectivement, pour modifier la préférence de cofacteur de la réduction du 3-cétobutyryl-CoA de l'utilisation du NADH à l'utilisation du NADPH. Les auteurs ont ensuite construit diverses combinaisons des différentes enzymes (de celles trouvées dans la voie d'oxydation inverse et les enzymes utilisant le NADPH) en surexprimant différents gènes dans des cultures de S. elongatus PCC 7942. Pour ce faire, ils ont construit des plasmides contenant les gènes correspondant aux enzymes et les a combinés dans le génome de S. elongates. Après des tests enzymatiques, la souche de cyanobactéries exprimant le NADPH utilisant des enzymes a produit la plus grande quantité de 1-butanol (29,9 mg/L), dépassant de quatre fois celle des souches qui n'étaient pas constituées d'enzymes utilisant le NADPH. Dans l'ensemble, le 1-butanol a été produit chez S. elongatus en utilisant une voie issue d'un autre organisme. Cette voie a été modifiée afin de correspondre au cofacteur réducteur préféré des cyanobactéries.

Modification du flux de métabolites avec un équilibre de cofacteur

Dans l'ingénierie des cofacteurs, une voie métabolique est modifiée en modifiant les concentrations de cofacteurs spécifiques qui sont produits soit dans cette voie particulière, soit dans une voie distincte. Par exemple, un organisme hypothétique pourrait avoir deux voies arbitraires appelées A et B où certaines enzymes de A et B utilisent les mêmes cofacteurs. Si les scientifiques voulaient diminuer la sortie de la voie A, ils pourraient d'abord envisager de concevoir directement les enzymes impliquées dans A, peut-être pour diminuer l' affinité d' un site actif particulier pour son substrat . Dans certains cas cependant, les enzymes de A peuvent être difficiles à fabriquer pour diverses raisons, ou il peut être impossible de les fabriquer sans affecter dangereusement une troisième voie métabolique C, qui utilise les mêmes enzymes. En tant qu'option distincte, les scientifiques pourraient augmenter le flux de B, ce qui peut être plus facile à concevoir. Cela pourrait à son tour "fixer" les cofacteurs nécessaires à A, ce qui ralentirait l'activité enzymatique , diminuant la production de A. C'est un exemple hypothétique de la façon dont l'ingénierie des cofacteurs peut être utilisée, mais il existe de nombreux autres cas uniques où les scientifiques utilisent des cofacteurs comme un moyen de modifier les voies métaboliques. Un avantage majeur de l'ingénierie des cofacteurs est que les scientifiques peuvent l'utiliser pour modifier avec succès des voies métaboliques difficiles à concevoir au moyen d'une ingénierie métabolique ordinaire. Ceci est réalisé en ciblant des enzymes plus facilement conçues dans des voies distinctes, qui utilisent les mêmes cofacteurs. Étant donné que de nombreux cofacteurs sont utilisés par différentes enzymes dans de multiples voies, l'ingénierie des cofacteurs peut être une alternative efficace et rentable aux méthodes actuelles d'ingénierie métabolique.

Les levures sont couramment utilisées dans l'industrie de la bière et du vin car elles sont capables de produire efficacement de l' éthanol par la voie métabolique de la fermentation en l'absence d'oxygène. La fermentation nécessite l'enzyme glycérol-3-phosphate déshydrogénase (GPDH) qui dépend du cofacteur NADH . Cette voie implique la conversion du glucose en éthanol et en glycérol , qui utilisent tous deux le NADH comme cofacteur . Les scientifiques ont conçu Saccharomyces cerevisiae pour surproduire la GPDH, ce qui a déplacé le flux métabolique des cellules de l'éthanol vers le glycérol, en limitant la disponibilité du NADH dans la partie de production d'éthanol de la voie. L'effet inverse a été obtenu en influençant une voie distincte dans la cellule, la voie de synthèse du glutamate . L'inactivation de l'expression de l'enzyme glutamate déshydrogénase , qui dépend du NADPH , et la surexpression des enzymes glutamine synthétase et glutamate synthétase , qui dépendent du NADH comme cofacteur, ont modifié l'équilibre des cofacteurs dans la voie de synthèse du glutamate. La voie dépend maintenant du NADH plutôt que du NADPH, ce qui diminue la disponibilité du NADH dans la voie de fermentation. Cela entraîne à son tour une augmentation de la production d'éthanol et une diminution de la production de glycérol . Cette méthode de manipulation des flux métaboliques pourrait être visualisée un peu comme les marchés mondiaux des carburants, où l'augmentation de la production d'éthanol pour une utilisation dans l'industrie automobile réduirait sa disponibilité dans l'industrie alimentaire. Essentiellement, produire plus de moteurs fonctionnant à l'éthanol pourrait entraîner une diminution de la consommation de bonbons transformés, qui contiennent du sirop de maïs à haute teneur en fructose . Cette ingénierie des cofacteurs est applicable à l'industrie de la bière et du vin car elle permet de réguler les niveaux d'éthanol dans les boissons alcoolisées. Les progrès de l'industrie du vin ont entraîné une augmentation constante de la teneur en éthanol, de sorte que les viticulteurs en particulier seraient intéressés par la possibilité de réduire les niveaux d'éthanol de certains de leurs vins.

Le cycle de l'acide citrique

La coenzyme A (CoA) et l' acétyl-CoA sont deux métabolites intermédiaires , notamment présents dans le cycle de l'acide citrique , qui participent à plus de 100 réactions différentes dans le métabolisme des micro-organismes. Des expériences récentes ont montré que la surexpression de l' enzyme pantothénate kinase et la supplémentation en acide pantothénique dans la voie de biosynthèse du CoA ont permis des ajustements des flux de CoA et d'acétyl-CoA. Cette concentration accrue de cofacteurs a entraîné une augmentation du flux de carbone dans la voie de synthèse de l'acétate d'isoamyle , augmentant l'efficacité de la production d'acétate d'isoamyle. L'acétate d'isoamyle est utilisé industriellement pour l'aromatisation artificielle et pour tester l'efficacité des respirateurs . En plus de la production d'acétate d'isoamyle, la manipulation de la biosynthèse de CoA au cours de la réaction de la pyruvate hydrogénase provoque également une augmentation de la production de succinate et de lycopène , dont chacun a des effets bénéfiques sur le corps humain. Une augmentation de la concentration de succinate, qui est utilisé comme catalyseur , peut entraîner une augmentation de la vitesse du cycle de l'acide citrique, et par conséquent du métabolisme d' un individu . Il a été démontré que l'augmentation des concentrations de lycopène diminue le risque de cancer de la prostate . Les récompenses potentielles de la répétition d'un tel exploit d'ingénierie des cofacteurs et de leur intégration réussie dans les pratiques de l'industrie sont innombrables.

Fabrication de papier

De nombreuses enzymes industrielles importantes utilisent des cofacteurs pour catalyser les réactions. En utilisant des cofacteurs pour manipuler les voies métaboliques , il est possible de réduire le coût des matériaux, d'éliminer les étapes de production, de réduire le temps de production, de diminuer la pollution et d'augmenter l'efficacité globale de la production. Un cas qui démontre plusieurs de ces avantages de fabrication implique le génie génétique des trembles . Dans le processus de fabrication du papier, les usines de fabrication doivent décomposer la lignine , un composé biochimique qui donne au tronc d'arbre sa rigidité, afin de former la pâte utilisée dans le reste de la production. Le processus de réduction en pâte chimique nécessite que l'usine de fabrication utilise une quantité importante d'énergie, ainsi que de nombreux produits chimiques coûteux et toxiques. Un groupe d'ingénieurs en génétique, grâce à l' ingénierie des cofacteurs , a conçu un tremble génétiquement supérieur qui produisait moins de lignine. Ces arbres génétiquement modifiés ont permis aux papeteries de réduire leurs coûts, leur pollution et leur temps de fabrication.

Autres exemples

Organisme	Ce qui est changé	Ce que cela veut dire
Mycobactérie smegmatis	Coenzyme F420	Pourrait désactiver un cofacteur qui conduit à la tuberculose résistante aux médicaments
Cyanobactéries	Cofacteur Fer-Molybdène	Production d'hydrogène gazeux pour l'énergie
Royaume Archéa	Molybdène nitrogénase cofacteur	Amélioration de l'efficacité de la fixation de l' azote
Thermoanaérobactéries mathranii	glycérol déshydrogénase	Faire en sorte que les bactéries thermophiles produisent de l' éthanol plus efficacement

Une brève description d'autres exemples significatifs où l'ingénierie des cofacteurs a été utilisée.

Remarques