Reprogrammation - Reprogramming
En biologie, la reprogrammation fait référence à l'effacement et au remodelage des marques épigénétiques , telles que la méthylation de l'ADN , au cours du développement des mammifères ou en culture cellulaire. Un tel contrôle est également souvent associé à d'autres modifications covalentes des histones .
Des reprogrammations à la fois à grande échelle (10 à 100 % des marques épigénétiques) et rapides (de quelques heures à quelques jours) se produisent à trois stades de la vie des mammifères. Près de 100 % des marques épigénétiques sont reprogrammées en deux courtes périodes au début du développement après la fécondation d'un ovule par un spermatozoïde . De plus, près de 10 % des méthylations de l' ADN dans les neurones de l'hippocampe peuvent être rapidement modifiées lors de la formation d'une forte mémoire de peur.
Après la fécondation chez les mammifères, les schémas de méthylation de l'ADN sont largement effacés puis rétablis au début du développement embryonnaire. Presque toutes les méthylations des parents sont effacées, d'abord au cours de l' embryogenèse précoce , puis de nouveau au cours de la gamétogenèse , avec une déméthylation et une reméthylation se produisant à chaque fois. La déméthylation au cours de l'embryogenèse précoce se produit dans la période préimplantatoire. Après qu'un spermatozoïde ait fécondé un ovule pour former un zygote , une déméthylation rapide de l'ADN paternel et une déméthylation plus lente de l'ADN maternel se produisent jusqu'à la formation d'une morula qui n'a presque pas de méthylation. Après la formation du blastocyste , la méthylation peut commencer, et avec la formation de l' épiblaste, une vague de méthylation a lieu jusqu'au stade de l'implantation de l'embryon. Une autre période de déméthylation rapide et presque complète se produit au cours de la gamétogenèse au sein des cellules germinales primordiales (PGC). Outre les PGC, au stade post-implantation, les schémas de méthylation dans les cellules somatiques sont spécifiques au stade et au tissu avec des changements qui définissent vraisemblablement chaque type de cellule individuel et durent de manière stable sur une longue période.
Développement embryonnaire
Le génome du sperme de souris est méthylé à 80-90% au niveau de ses sites CpG dans l'ADN, soit environ 20 millions de sites méthylés. Après la fécondation , le chromosome paternel est presque complètement déméthylé en six heures par un processus actif, avant la réplication de l'ADN (ligne bleue sur la figure). Dans l' ovocyte mature , environ 40 % de ses sites CpG sont méthylés. La déméthylation du chromosome maternel se produit en grande partie par le blocage des enzymes de méthylation d'agir sur l'ADN d'origine maternelle et par la dilution de l'ADN maternel méthylé pendant la réplication (ligne rouge sur la figure). La morula (au stade de 16 cellules) n'a qu'une petite quantité de méthylation de l' ADN (ligne noire sur la figure). La méthylation commence à augmenter à 3,5 jours après la fécondation dans le blastocyste , et une grande vague de méthylation se produit alors aux jours 4,5 à 5,5 dans l' épiblaste , passant de 12% à 62% de méthylation, et atteignant un niveau maximum après implantation dans l'utérus. Au septième jour après la fécondation, les cellules germinales primordiales nouvellement formées (PGC) dans l' embryon implanté se séparent des cellules somatiques restantes . À ce stade, les PGC ont à peu près le même niveau de méthylation que les cellules somatiques.
Les cellules germinales primordiales nouvellement formées (PGC) dans l'embryon implanté sont issues des cellules somatiques. À ce stade, les PGC ont des niveaux élevés de méthylation. Ces cellules migrent de l'épiblaste vers la crête gonadique . Maintenant, les cellules prolifèrent rapidement et commencent la déméthylation en deux vagues. Dans la première vague, la déméthylation se fait par dilution réplicative, mais dans la deuxième vague, la déméthylation se fait par un processus actif. La deuxième vague conduit à la déméthylation de loci spécifiques. À ce stade, les génomes PGC affichent les niveaux les plus bas de méthylation de l'ADN de toutes les cellules de tout le cycle de vie [au jour embryonnaire 13,5 (E13,5), voir la deuxième figure de cette section].
Après la fécondation, certaines cellules de l'embryon nouvellement formé migrent vers la crête germinale et deviendront éventuellement les cellules germinales (sperme et ovocytes) de la génération suivante. En raison du phénomène d' empreinte génomique , les génomes maternels et paternels sont marqués différemment et doivent être correctement reprogrammés à chaque passage dans la lignée germinale. Par conséquent, au cours du processus de gamétogenèse, les modèles de méthylation de l'ADN biparental d'origine des cellules germinales primordiales doivent être effacés et rétablis en fonction du sexe du parent transmetteur.
Après la fécondation, les génomes paternel et maternel sont déméthylés afin d'effacer leurs signatures épigénétiques et acquérir la totipotence. Il y a asymétrie à ce stade : le pronucleus mâle subit une déméthylation rapide et active. Pendant ce temps, le pronucleus femelle est déméthylé passivement au cours de divisions cellulaires consécutives. Le processus de déméthylation de l' ADN implique la réparation par excision des bases et probablement d'autres mécanismes basés sur la réparation de l'ADN. Malgré la nature globale de ce processus, certaines séquences l'évitent, comme les régions méthylées différentiellement (DMRS) associées à des gènes imprimés, des rétrotransposons et de l' hétérochromatine centromérique . La reméthylation est à nouveau nécessaire pour différencier l'embryon en un organisme complet.
Il a été démontré que la manipulation in vitro d'embryons préimplantatoires perturbe les schémas de méthylation au niveau des loci imprimés et joue un rôle crucial chez les animaux clonés.
Apprentissage et mémoire
L'apprentissage et la mémoire ont des niveaux de permanence, différents des autres processus mentaux tels que la pensée, le langage et la conscience, qui sont de nature temporaire. L'apprentissage et la mémoire peuvent s'accumuler lentement (tables de multiplication) ou rapidement (toucher un poêle chaud), mais une fois atteints, ils peuvent être rappelés à une utilisation consciente pendant une longue période. Les rats soumis à un cas de conditionnement de la peur contextuelle créent une mémoire à long terme particulièrement forte. 24 h après l'entraînement, 9,17 % des gènes des génomes de rat des neurones de l'hippocampe se sont avérés être méthylés de manière différentielle . Cela comprenait plus de 2 000 gènes différentiellement méthylés 24 heures après l'entraînement, avec plus de 500 gènes déméthylés. La région de l'hippocampe du cerveau est l'endroit où les souvenirs contextuels de la peur sont d'abord stockés (voir la figure du cerveau, cette section), mais ce stockage est transitoire et ne reste pas dans l'hippocampe. Chez le rat, le conditionnement de la peur contextuelle est aboli lorsque l'hippocampe est soumis à une hippocampectomie juste 1 jour après le conditionnement, mais les rats conservent une quantité considérable de peur contextuelle lorsqu'un long délai (28 jours) est imposé entre le moment du conditionnement et le moment de l'hippocampectomie.
Stades moléculaires
Trois étapes moléculaires sont nécessaires pour reprogrammer l' ADN méthylome . Étape 1 : Recrutement. Les enzymes nécessaires à la reprogrammation sont recrutées sur les sites du génome qui nécessitent une déméthylation ou une méthylation. Étape 2 : Mise en œuvre. Les premières réactions enzymatiques ont lieu. Dans le cas de la méthylation, il s'agit d'une étape courte qui aboutit à la méthylation de la cytosine en 5-méthylcytosine. Étape 3 : réparation de l'ADN par excision de base. Les produits intermédiaires de la déméthylation sont catalysés par des enzymes spécifiques de la voie de réparation de l'ADN par excision de bases qui restaurent finalement la cystosine dans la séquence d'ADN.
La figure de cette section indique les rôles centraux de la translocation dix à onze méthylcytosine dioxygénases (TET) dans la déméthylation de la 5-méthylcytosine pour former la cytosine. Comme examiné en 2018, 5mC est très souvent initialement oxydé par des dioxygénases TET pour générer de la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC). Par étapes successives (voir la figure), les enzymes TET hydroxylent davantage 5hmC pour générer de la 5-formylcytosine (5fC) et de la 5-carboxylcytosine (5caC). La thymine-ADN glycosylase (TDG) reconnaît les bases intermédiaires 5fC et 5caC et excise la liaison glycosidique résultant en un site apyrimidinique (site AP). Dans une voie alternative de désamination oxydative, le 5hmC peut être désaminé par oxydation par les désaminases APOBEC (AID/APOBEC) pour former le 5-hydroxyméthyluracile (5hmU) ou 5mC peut être converti en thymine (Thy). 5hmU peut être clivé par TDG, SMUG1 , NEIL1 ou MBD4 . Les sites AP et les mésappariements T:G sont ensuite réparés par des enzymes de réparation par excision de base (BER) pour produire de la cytosine (Cyt).
famille TET
Les isoformes des enzymes TET comprennent au moins deux isoformes de TET1, une de TET2 et trois isoformes de TET3. L'isoforme canonique TET1 de pleine longueur semble pratiquement limitée aux embryons précoces, aux cellules souches embryonnaires et aux cellules germinales primordiales (PGC). L'isoforme dominante de TET1 dans la plupart des tissus somatiques, au moins chez la souris, provient de l'utilisation alternative de promoteurs qui donne lieu à un court transcrit et à une protéine tronquée appelée TET1. Les isoformes de TET3 sont la forme pleine longueur TET3FL, une variante d'épissage de forme courte TET3s et une forme qui se produit dans les ovocytes et les neurones désignés TET3o. TET3o est créé par l'utilisation de promoteurs alternatifs et contient un premier exon N-terminal supplémentaire codant pour 11 acides aminés. TET3o se produit uniquement dans les ovocytes et les neurones et n'a pas été exprimé dans les cellules souches embryonnaires ou dans tout autre type de cellule ou tissu de souris adulte testé. Alors que l'expression de TET1 peut à peine être détectée dans les ovocytes et les zygotes et que TET2 n'est que modérément exprimée, la variante TET3 TET3o montre des niveaux d'expression extrêmement élevés dans les ovocytes et les zygotes, mais est presque absente au stade 2 cellules. Il est possible que la TET3o, riche en neurones, ovocytes et zygotes au stade cellulaire, soit la principale enzyme TET utilisée lorsque des déméthylations rapides à très grande échelle se produisent dans ces cellules.
Recrutement du TET à l'ADN
Les enzymes TET ne se lient pas spécifiquement à la 5-méthylcytosine, sauf lorsqu'elles sont recrutées. Sans recrutement ni ciblage, TET1 se lie principalement aux promoteurs de CG élevés et aux îles CpG (CGI) à l'échelle du génome par son domaine CXXC qui peut reconnaître les CGI non méthylés . TET2 n'a pas d'affinité pour la 5-méthylcytosine dans l'ADN. Le domaine CXXC du TET3 de pleine longueur, qui est la forme prédominante exprimée dans les neurones, se lie le plus fortement aux CpG où le C a été converti en 5-carboxycytosine (5caC). Cependant, il se lie également aux CpG non méthylés .
Pour qu'une enzyme TET initie la déméthylation, elle doit d'abord être recrutée sur un site CpG méthylé dans l'ADN. Deux des protéines dont il a été démontré qu'elles recrutent une enzyme TET en une cytosine méthylée dans l'ADN sont OGG1 (voir figure Initiation de la déméthylation de l'ADN) et EGR1 .
OGG1
L'oxoguanine glycosylase (OGG1) catalyse la première étape de la réparation par excision de la base 8-OHdG endommagée par l'oxydation . OGG1 trouve 8-OHdG en glissant le long de l'ADN linéaire à 1 000 paires de bases d'ADN en 0,1 seconde. OGG1 trouve très rapidement le 8-OHdG. Les protéines OGG1 se lient à l'ADN endommagé par oxydation avec un temps de demi-temps maximum d'environ 6 secondes. Lorsque OGG1 trouve 8-OHdG, il change de conformation et se complexe avec 8-OHdG dans la poche de liaison d'OGG1. OGG1 n'agit pas immédiatement pour éliminer le 8-OHdG. L'élimination à moitié maximale de 8-OHdG prend environ 30 minutes dans les cellules HeLa in vitro , ou environ 11 minutes dans le foie de souris irradiées. L'oxydation de l'ADN par des espèces réactives de l'oxygène se produit préférentiellement au niveau d'une guanine dans un site CpG méthylé, en raison d'un potentiel d'ionisation réduit des bases guanines adjacentes à la 5-méthylcytosine. TET1 se lie (est recruté à) l'OGG1 lié à 8-OHdG (voir figure). Cela permet probablement à TET1 de déméthyler une cytosine méthylée adjacente. Lorsque les cellules épithéliales mammaires humaines (MCF-10A) ont été traitées avec H 2 O 2 , 8-OHdG a augmenté de 3,5 fois dans l'ADN, ce qui a provoqué une déméthylation à grande échelle de la 5-méthylcytosine à environ 20 % de son niveau initial dans l'ADN.
EGR1
La protéine de réponse de croissance précoce du gène 1 ( EGR1 ) est un gène précoce immédiat (IEG). La caractéristique déterminante des IEG est la régulation à la hausse rapide et transitoire - en quelques minutes - de leurs niveaux d'ARNm indépendamment de la synthèse des protéines. EGR1 peut être induit rapidement par l'activité neuronale. À l'âge adulte, EGR1 est largement exprimé dans tout le cerveau, maintenant des niveaux d'expression de base dans plusieurs zones clés du cerveau, notamment le cortex préfrontal médian, le striatum, l'hippocampe et l'amygdale. Cette expression est liée au contrôle de la cognition, de la réponse émotionnelle, du comportement social et de la sensibilité à la récompense. EGR1 se lie à l'ADN aux sites avec les motifs 5'-GCGTGGGCG-3' et 5'-GCGGGGGCGG-3' et ces motifs apparaissent principalement dans les régions promotrices des gènes. L'isoforme courte TET1s est exprimée dans le cerveau. EGR1 et TET1 forment un complexe médié par les régions C-terminales des deux protéines, indépendamment de l'association avec l'ADN. EGR1 recrute les TET1 dans les régions génomiques flanquant les sites de liaison EGR1. En présence d'EGR1, TET1s est capable de déméthylation spécifique au locus et d'activation de l'expression de gènes en aval régulés par EGR1.
Dans les systèmes de culture cellulaire
La reprogrammation peut également être induite artificiellement par l'introduction de facteurs exogènes, généralement des facteurs de transcription . Dans ce contexte, il fait souvent référence à la création de cellules souches pluripotentes induites à partir de cellules matures telles que des fibroblastes adultes . Cela permet la production de cellules souches pour la recherche biomédicale , comme la recherche sur les thérapies par cellules souches , sans utiliser d'embryons. Elle est réalisée par la transfection de gènes associés aux cellules souches dans des cellules matures à l'aide de vecteurs viraux tels que les rétrovirus .
Histoire
La première personne à avoir réussi à démontrer la reprogrammation était John Gurdon , qui a démontré en 1962 que les cellules somatiques différenciées pouvaient être reprogrammées à l'état embryonnaire lorsqu'il a réussi à obtenir des têtards nageurs après le transfert de cellules épithéliales intestinales différenciées dans des œufs de grenouille énucléés. Pour cette réalisation, il a reçu le prix Nobel de médecine 2012 aux côtés de Shinya Yamanaka . Yamanaka a été le premier à démontrer (en 2006) que ce processus de transfert nucléaire de cellules somatiques ou de reprogrammation à base d'ovocytes (voir ci-dessous), découvert par Gurdon, pouvait être récapitulé (chez la souris) par des facteurs définis ( Oct4 , Sox2 , Klf4 et c -Myc ) pour générer des cellules souches pluripotentes induites (iPSCs). D'autres combinaisons de gènes ont également été utilisées.
Variabilité
Les propriétés des cellules obtenues après reprogrammation peuvent varier de manière significative, en particulier parmi les iPSC. Les facteurs conduisant à une variation des performances de reprogrammation et des caractéristiques fonctionnelles des produits finaux comprennent le fond génétique, la source tissulaire, la stoechiométrie des facteurs de reprogrammation et les facteurs de stress liés à la culture cellulaire.
Transfert nucléaire de cellules somatiques
Un ovocyte peut reprogrammer un noyau adulte à l'état embryonnaire après le transfert nucléaire d'une cellule somatique , de sorte qu'un nouvel organisme puisse être développé à partir de cette cellule.
La reprogrammation est distincte du développement d'un épitype somatique , car les épitypes somatiques peuvent potentiellement être modifiés après qu'un organisme a quitté le stade de développement de la vie. Au cours du transfert nucléaire des cellules somatiques, l'ovocyte désactive les gènes spécifiques aux tissus dans le noyau des cellules somatiques et réactive les gènes spécifiques à l'embryon.